环状RNA在急性缺血性脑卒中的研究进展

王孟可综述, 程门雪, 苏志强审校

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)是由于大脑动脉闭塞、脑灌注不足、栓塞(心源性栓子脱落、动脉-动脉栓塞)等引起脑血流量减少导致脑功能迅速丧失的结果。其病理机制涉及炎症反应、氧化应激、免疫反应、细胞凋亡和自噬等,造成脑部神经功能不可逆损伤;全球每年脑卒中发生将近1 500万人,据调查每4个成年人中就有1人在一生中经历过卒中,其中85%以上是AIS[1,2]。AIS具有极高的致死、致残、复发率,严重危害人民健康,给社会及家庭造成了沉重的经济负担。目前AIS治疗主要是静脉溶栓和机械取栓,但受到许多因素的限制,特别是治疗窗口狭窄以及再灌注损伤等原因导致临床疗效不尽人意,重要的是脑缺血损伤的机制尚不清楚,还需要进一步深入研究。

环状RNA(circular RNA,CircRNA)是近年兴起的一类以共价键形成闭环结构的内源性RNA分子,与线性RNA不同的是,它们不是通过RNA剪接的规范模式产生的。CircRNA分子通过独特的反向剪接将3′和5′端连接在一起而环化,由于其没有5′帽子结构和3′poly(A)尾巴的极性结构,不易被核糖核酸外切酶R(RibonucleaseR,RNaseR)所识别,能逃脱RNaseR的脱帽效应而不被水解,具有高度稳定性、组织表达特异性和生物进化保守性等特点。自2013年以miR-7海绵为功能的CircCDR1as的里程碑式[3]发现以来,CircRNA已经成为各国学者研究的课题,近十年来,CircRNA陆续在癌症、心血管疾病、神经系统疾病中被发现,已发现它们可以作为miRNA海绵、蛋白质脚手架,甚至翻译模板在基因表达调控、细胞通讯及蛋白翻译等方面发挥重要生物学功能。

1 环状RNA的简介

1.1 CircRNA的分类与生物发生机制 CircRNA于1976年(见图1)被最早发现[4],根据其是否保留内含子可分为:外显子CircRNA、保留内含子的CircRNA和内含子CircRNA;自然界以外显子CircRNA为主,其主要位于细胞质,另外两种通常位于细胞核[5]。CircRNA有3种主要的生物发生机制:(1)套索驱动环化:mRNA前体剪接时,依赖反式作用因子发生外显子跳读事件,导致从剪接供体的3′端到剪接受体的5′端的共价剪接,形成含外显子的套索结构,套索通过剪接体连接后去除内含子后成环。(2)内含子反向互补序列驱动环化:外显子两端的侧翼内含子反向互补序列促使内含子序列配对,在空间上缩小了剪接供体与剪接受体的距离,使得下游的剪接供体与上游的剪接受体靠近结合形成CircRNA。(3)RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)驱动环化:环化外显子两端的侧翼内含子含有RBP识别的基序,RBP分别与两翼内含子特异基序结合后形成二聚体,促进两翼内含子互相靠近,进而连接成环[6]。

图1 从HeLa细胞细胞质中提取的环状RNA分子电镜照片[4]

1.2 CircRNA的功能 (1)CircRNA富含miRNA结合位点,可作为miRNA海绵调节miRNA的活性和基因转录,大多数CircRNA可以作为竞争性内源性RNA(ceRNA)与mRNA竞争地结合miRNA,并与miRNA相互作用,解除miRNA对其下游靶mRNA的抑制,提高细胞中mRNA的表达水平[7]。(2)CircRNA与蛋白质相互作用:①CircRNA作为蛋白质的海绵或诱饵,间接影响疾病的进展[8];②CircRNA与特定的蛋白质相互作用并增强其功能;③CircRNA作为蛋白质支架促进酶及其底物的共定位,从而影响反应动力学;④将多蛋白复合体的成分招募到特定的位置或亚细胞区域以调节基因水平[9];⑤CircRNA在mRNA调控作用下与RBP结合并相互作用,从而调节蛋白质活性并改变mRNA的剪接模式[10]。(3)CircRNA直接编码蛋白质,尽管CircRNA被认为是特殊类型的非编码RNA,但研究表明一些CircRNA可以作为翻译模板编码蛋白质,这种翻译机制被称为帽非依赖性翻译。CircRNA编码蛋白质的3种主要翻译模式包括:①依赖于内部核糖体进入位点(IRES)的CircRNA翻译。②依赖于m6A内部核糖体进入位点(MIRES)的CircRNA翻译。③CircRNA的滚动翻译机制(RCA)[11]。

2 环状RNA与AIS

CircRNA具有组织器官特异性并在神经系统显著富集[12,13],其不仅参与人类大脑发育过程,并在AIS脑损伤中发挥重要作用。大量研究发现AIS会引起CircRNA的表达水平和功能显著改变,调节CircRNA水平可以显著改善脑损伤。AIS后脑细胞缺血缺氧,驱动炎症反应和氧化应激,导致神经细胞坏死、凋亡以及血脑屏障破坏。当血脑屏障受损时,下调或者上调表达的CircRNA从大脑释放到循环系统并在外周测量,从而使患者体内的CircRNA水平通过外周血液检测到并用来判断预后,帮助临床医生监测AIS患者的治疗进展。本文将从神经细胞凋亡、自噬、血管生成、人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)凋亡与神经元可塑性5个方面来讨论CircRNA在AIS中的作用机制。

2.1 CircRNA与神经细胞凋亡 凋亡又称为程序性细胞死亡,是细胞死亡的一种形式,即在一定的生理或病理条件下,机体为维护内环境的稳定,遵循自身程序,通过一定的信号传导途径,激活DNA内切酶,使细胞主动死亡的过程,细胞凋亡是缺血性卒中后神经元丢失的重要机制[13]。研究发现,体外脑缺血再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)处理的小鼠海马神经元细胞HT22和体内大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠中,CircCDC14A的表达显著上调;敲低CircCDC14A可提高细胞存活率,抑制OGD/R引起的细胞活力降低、细胞损伤和细胞凋亡以及MCAO诱导的脑梗死、脑组织损伤;CircCDC14A作为miR-23a-3p的海绵,通过负性调节miR-23a-3p促进趋化因子基质细胞衍生因子CXCL12的表达而促进神经元缺血再灌注损伤[14]。在OGD诱导的HT22细胞和MCAO小鼠模型中,Circ-HECTD1显著上调,敲低Circ-HECTD1可上调miR-133b,抑制miR-133b靶基因肿瘤坏死因子受体作用因子3(TRAF3)表达,体外缓解了OGD引起的神经细胞凋亡,体内减少了MCAO小鼠的脑梗死体积[15]。在MACO模型小鼠中,CircUCK2水平上调显著减少梗死体积和神经元损伤,改善神经功能缺损;CircUCK2作为miR-125b-5p分子的海绵,吸引结合并抑制miR-125b-5p分子的功能,使小鼠脑组织生长分化因子11(GDF11)表达显著增加,从而减少氧葡萄糖剥夺(OGD)诱导的细胞凋亡;过表达CircUCK2通过调节miR-125b-5p/GDF11表达激活下游TGF信号通路,从而提高神经细胞存活率,减轻神经元损伤,从而发挥神经保护功能[16]。在AIS患者血液标本和OGD处理的HCN-2细胞模型中,Circ_0007290的表达显著增加,Circ_0007290作为海绵结合miR-496,从而解除对其靶基因PDCD_4的抑制,敲低Circ_0007290可减轻神经细胞凋亡[17]。Circ-0012397通过海绵miR-200a-3p调控Corin表达,高表达水平的Corin通过下调裂解的半胱天冬酶-5、BCL-3相关死亡启动子、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白2的表达,增强了OGD诱导的SHSY38Y神经母细胞瘤细胞增殖并抑制凋亡[18]。

2.2 CircRNA与神经细胞自噬 自噬是真核细胞的一个维持自我稳定的生物学过程。在缺血性卒中过程中,神经细胞自噬状态的激活可以消除细胞中功能失调的蛋白质,从而使神经细胞活性增加。而自噬的作用具有两面性,适度的自噬虽可以保持神经细胞活性,但如果神经细胞一直保持在高水平的自噬,则会导致神经细胞死亡[13]。CircRNA被证实广泛参与AIS的神经元自噬调节,且多发挥积极作用,多种CircRNA被发现可作为分子海绵显著缩小脑梗死面积,减轻神经元损伤,抑制星形胶质细胞的激活和自噬。在MCAO小鼠的星形胶质细胞和脑组织中,Circ_0025984作为miR-143-3p的海绵直接靶向TET1并降低其表达,Circ_0025984治疗显著降低MCAO小鼠的星形胶质细胞自噬、脑损伤和神经元丢失[19]。在AIS血浆样本和MCAO模型小鼠脑组织中,CircCDC14A和CircHECTD1显著增加;体内、外,通过敲低CircCDC14A和CircHECTD1基因,抑制星形胶质细胞的激活和自噬,可显著缩小脑梗死面积和神经元损伤;CircHECTD1/miR-142轴通过调节下游的TIPARP来促进星形胶质细胞的激活和自噬[20,21]。CircCELF1在OGD/R诱导的星形胶质细胞中上调,敲低CircCELF1可抑制星形胶质细胞自噬。使用tMCAO模型进行的体内研究还显示,CircCELF1下调有助于抑制神经损伤[22]。

2.3 CircRNA与神经血管生成 血脑屏障(BBB)是维持脑内的动态平衡、保护大脑的独特屏障。人脑微血管内皮细胞(HBMEC)是BBB的最主要构成部分。在AIS中,血脑屏障的结构以及完整性破坏,导致脑损伤和有害物质进入大脑。作为构成BBB的重要组成部分,HBMEC在AIS中发挥着重要功能。经OGD/R处理后,HBMEC的存活、迁移和血管生成减少,释放炎症因子,导致细胞死亡和凋亡,诱导内皮细胞间充质转化(endothelial mesenchymal transformation,EndoMT),破坏血脑屏障的完整性。血管生成是缺血性脑损伤的关键修复机制,有助于功能恢复。增强的血管生成可以触发轴突生长,这是促进神经元重塑的方法之一,环状RNA是参与血管生成的重要调节因子[23]。研究证实,在AIS患者外周血和OGD处理的HBMEC中,CircFunc1的表达增加;敲低CircFundc1基因,miR-375抑制解除,减轻了OGD诱导的细胞凋亡,促进了OGD阻断的HBMEC的细胞活力、迁移和血管生成,然而PTEN的过表达消除了miR-375的恢复作用;CircFundc1基因敲低通过丰富miR-375和抑制PTEN来减轻OGD诱导的细胞损伤[24]。AIS患者外周血中CircPHKA2表达下调,体外OGD模型中,CircPHKA2通过结合、抑制miR-574-5p从而上调SOD2的表达来保护HBMEC免受脑缺血后糖氧剥夺导致的损伤,过表达CircPHKA2促使OGD后HBMEC增殖、迁移和新生血管形成[25]。Circ_0006768通过抑制miR-222-3p上调VEZF3减弱OGD/R对细胞活力、迁移和血管生成的抑制作用,减轻OGD/R导致的HBMEC损伤[26]。

2.4 CircRNA与HBMEC凋亡 缺血缺氧条件下可导致强烈的氧化应激,产生大量自由基以及氧化中间产物,HBMEC是其攻击的主要目标,HBMEC是构成BBB的重要结构,作为脑组织与外周循环之间的屏障,HBMEC完整性对维持脑部的稳态至关重要,HBMEC损伤则进一步驱动脑部炎症反应和氧化应激,导致坏死和细胞凋亡[27]。通过调节CircRNA表达抑制HBMEC细胞凋亡、改善神经功能对于未来AIS治疗具有潜在研究价值。Circ-Memo1沉默通过调节miR-17-5p/SOS1轴抑制ERK/NF-κB信号通路,减轻HBMEC细胞的缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤、提高HBMEC细胞存活率、抑制HBMEC凋亡[28]。ACVR2B是miR-18a-5p的直接靶标,Circ_0000566作为miR-18a-5p海绵,通过调节miR-18a-5p/ACVR2B轴,促进OGD/R诱导的HBMEC损伤[29]。沉默Circ_0010729可上调miR-5,从而抑制靶基因ING665表达,促进OGD/R诱导的HBMEC细胞增殖并抑制凋亡[30]。下调Circ_0006459通过miR-940/FOXJ2途径保护HBMEC免受OGD引起的损伤,减少HBMEC凋亡[31]。

2.5 CircRNA与神经元可塑性 CircRNA通过增强短期或长期的神经元可塑性可以显著改善疾病发生发展。小鼠缺血脑组织和AIS患者外周血浆中的CircSCMH1显著降低;卒中后注射外泌体CircSCMH1可明显促进小鼠和猴子神经功能恢复;CircSCMH1进入细胞核,与转录因子MeCP2机械结合,解除了对MeCP2下游靶基因(mobP、IGFBP3、Fxyd1、Prodh)转录的抑制,增强了神经元的可塑性,抑制了胶质细胞的激活和外周免疫细胞的侵袭,从而促进AIS的功能恢复[32]。而Yu等也通过生物信息学中基因本体(GO)和京都基因组百科全书(KEGG)分析研究中发现CircARHGAP3和CircLPHN为神经元突触可塑性调节的关键CircRNA[33]。

3 小结与展望

随着近十年来CircRNA的相关报道不断增加,人们对CircRNA的了解也不断深入,既往研究虽未能对CircRNA在AIS发生发展中的作用机制进行统一表征和权威论证,但文中提及的研究确实可作为有力的经验证据证明CircRNA参与了AIS病因发生及病理变化等过程,并在其中起重要作用,甚至证明CircRNA可作为脑梗死潜在诊断生物标志物和脑血管保护的新型治疗靶标。但是目前大部分数据是从细胞和动物水平得到,从理论过渡到试验再到临床诊疗方式的推广仍然需要一个漫长的过程。CircRNA在AIS发生发展过程中的作用及其对AIS临床诊断和治疗方面的潜在作用仍需要开展大量深入研究。