基于关联规则与k 均值聚类探讨黄褐斑外用方剂的药理规律

秦天歌，周扬，韩露，张霞，陈维玲，李建红

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

黄褐斑是一种常见的难治性面部色素沉着性皮肤病，现存最早的与黄褐斑有关的描述见于战国时期的《黄帝内经·素问·至真要大论篇》[1]：“岁阳明在泉，燥淫所胜……甚则嗌干面尘，身无膏泽”，将黄褐斑称之为“面尘”。中医将黄褐斑又称之为“黧黑斑”“肝斑”等[2]。此病发于面部，顽固难愈，影响外观，常对患者的自我认知、人际交往及工作等方面造成负面影响。

目前黄褐斑的临床治疗方法有口服系统药物、外用局部色素减退剂、化学剥脱及激光治疗等，多以单一或多种外用方法联合口服药物治疗，辅以激光治疗[3-4]。中医认为本病与肝、脾、肾三脏关系密切，肝郁、脾湿、肾虚皆为发病之根，气血瘀滞、络脉不通、颜面失于濡养为病机之关键[5]。中医外治疗法可直达病所，治疗黄褐斑往往收效甚佳，且用法相对安全，患者接受度较高。本研究通过整理中医古籍中黄褐斑外用方剂，进一步建立现代临床中基于古方黄褐斑外用方药数据库，进行数据聚类分析和药理机制研究，探讨中医外治法治疗黄褐斑的用药规律及机制，为黄褐斑外用方剂提供分子机制层面的参考依据，为临床遣方用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源与检索方式

1.1.1 古籍资料 以《中华医典》（第5 版）[6]为检索源，以“黄褐斑”“面尘”“面皯”“面黑皯”和“皯黯”为关键词进行检索，对条文进行合并删重及详细记录。

1.1.2 临床相关文献 所有文献来源于中国知网（CNKI）、万方数据库（Wanfang Data）、维普中文期刊数据库（VIP），以“黄褐斑”“肝斑”“蝴蝶斑”“妊娠斑”“黧黑斑”“面尘”“外用”和“外治法”等为主题词进行交叉检索，所收集文献截止时间为2020 年11 月31 日，并对文献进行合并删重及详细记录。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 古方纳入和排除标准 纳入标准：①条文中包含明确说明用于治疗黄褐斑的外用处方；②方剂记录详细齐全。排除标准：①重复出现的方剂只记录1 次；②方剂药物组成不完整。

1.2.2 现代临床文献纳入和排除标准 纳入标准：①中药或中西医结合外用治疗黄褐斑的随机对照研究、医案报道、临床观察等研究；②外用方剂与上一步整理古方相关；③药物组成明确。排除标准：①重复发表的临床文献只记录1 次；②受其他药物影响，无法明确判断为中药疗效的临床研究。

1.3 名词术语标准化 将纳入的外用方剂进行整理，并对药物名称进行统一规范。忽略具体治疗方法，如糊剂、搽剂、熏蒸、外敷、敷贴等，将中药复方拆解转换为具体中药。中药名称规范标准参照2015版的《中华人民共和国药典》[7]，该版本药典未收录的药物名称，参考2006 年版的《中药大辞典》[8]，若仍未收录则沿用原始数据名称。

1.4 数据录入及分析 基于中医传承计算平台（V3.0）软件（中国中医科学院中药研究所）进行数据的录入、建库及分析，将临床文献整理汇总的处方相关信息以双人双机方式录入并进行审核，保证数据录入的准确性，建立黄褐斑外用方药数据库。

运用中医传承计算平台（V3.0）软件，录入文献中的方药信息，在此基础上建立数据库，结合处方数量以及临床经验，选择“方剂分析”，设置支持度为30、置信度为0.8，获取关联规则及核心药物组合。使用平台数据分析系统，基于k 均值聚类算法及回归模型对黄褐斑外用方剂进行聚类分析，获得核心组合，进一步对黄褐斑外用方剂的药物规律进行归纳总结。

1.5 疾病-靶点-通路-核心药物-有效成分网络构建

1.5.1 核心药物的有效成分筛选及其作用靶点获取 依据聚类分析结果，选取12 味核心药物作为现代临床中医外治黄褐斑的核心药物。使用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）数据库（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），分别检索 “白芷”“白术”“茯苓”“白附子”等，根据该数据库提供的设置“药物相似度（Drug-likeness，DL）≥0.18”筛选出符合条件的候选活性成分，并结合化学结构网、化源网、Drugbank、Batman-TCM 等药物数据库及文献检索，将不符合筛选参数，但有明确药理作用的活性成分补充进TCMSP 筛选结果。在TCMSP 数据库获取以上活性成分作用的蛋白质靶点，在Uniprot蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）中将靶点进行规范。

1.5.2 黄褐斑相关靶点的获取 以“Melasma”“Chloasma”作为关键词，在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）等疾病基因数据库进行检索。同时在基因表达数据库（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中以“Melasma”“Chloasma”为关键词检索，得到GPL570 [HG -U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 平台中相关蛋白芯片Series GSE7214，ID：200072140，对疾病靶点进行补充。将所有获取的靶点进行汇总及去重，使用Uniprot 数据库对所得靶点进行标准化，得到所有疾病靶点。

1.5.3 基因功能和通路富集分析 使用R 语言（https：//www.r-project.org）将核心药物有效成分靶点与黄褐斑靶点取交集并绘制韦恩图。使用R 语言的“clusterProfiler”“bioconductor”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”安装包对核心药物和黄褐斑交集靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组数据库（KEGG）通路富集分析及可视化。

1.5.4 “疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分”网络图的构建 根据上述所得到的核心药物潜在活性成分与作用靶点之间的关系，利用Cytoscape 3.7.2 软件建立疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分网络。

2 结果

2.1 古籍黄褐斑外用方剂药物统计 检索《中华医典》[6]得到474 条相关条文，经纳入和排除标准筛选后得到151 条条文，包含方剂37 首，涉及中药78 味，药物累计频次177 次。用药频率前5 位为茯苓、白芷、白附子、防风和苦杏仁，药物四气统计以温、平、寒性为主，药物五味统计以辛、甘、苦味为主。

2.2 现代临床黄褐斑外用方剂药物统计与分析

2.2.1 现代临床黄褐斑外用方剂药物统计 依据文献纳入和排除标准筛选得到文献424 篇，纳入中药复方309 个，涉及中药232 味，药物累计频数2 222次，其中使用频数≥50 次的药物11 味，前5 位依次为白芷、茯苓、当归、白及和白附子，见表1。四气频数前3 类为温（950 次，46.7%）、寒（574 次，28.2%）、平（433 次，21.3%）；五味频次前3 类为甘（930 次，30.9%）、辛（890 次，29.6%）、苦（882 次，29.3%）；归经频数前3 类为肝（1 190 次，22.3%）、胃（938 次，17.5%）、肺（927 次，17.3%），见图1。药物功效统计示以补虚类、解表类、活血化瘀、平肝息风类药物为主。

图1 黄褐斑外治方药的四气、五味、归经统计

表1 现代临床黄褐斑外用方剂中使用频数≥50 次的药物

2.2.2 基于关联规则的方剂组方规律分析 设置支持度个数为30，置信度为0.8（支持度：表示药对、三味药物及多味药物同时在至少30 首方剂中出现过；置信度：表示前后药物组合同时配伍出现的关联概率至少为80%）。

（1）药物组合频次分析：关联规则分析获得59 条药物组合，涉及12 味中药。高频药物组合有“白芷-茯苓”（111 次）、“白芷-白附子”（107 次）、“白芷-白及”（106 次）等，按照出现频数从高到低依次排序，前10 组药物组合见表2。

表2 现代临床黄褐斑外用方剂中出现频次前10 组药物

（2）药物组合关联规则分析：关联分析获得22 条药物关联规则，根据置信度由高到低排序，前3 组的关联规则为 “白及-白蔹->白芷”（置信度0.90）、“茯苓-白附子-僵蚕->白芷”（置信度0.89）、“茯苓-白及-僵蚕->白芷”（置信度0.88）、“白蔹->白芷”（置信度0.88）等，前10 组药物组合见表3。使用中医传承计算平台中“网络展示”功能，对药物-药物关系进行网络可视化操作得到核心网络拓扑图，见图2，包含12 味核心药物，见表4。

图2 12 味核心药物网络拓扑图

表3 现代临床黄褐斑外用方剂中置信度前10 组药物组合

表4 现代临床黄褐斑外用方剂中核心药物分类

2.2.3 k 均值聚类算法聚类分析 基于k 均值聚类算法与回归模型对药物进行聚类分析，将治疗黄褐斑的外用药物分为4 类，常用的配伍组合包括白芷-茯苓-当归-白及，白芷-白附子-白及-僵蚕等，聚类分析结果见表5。

表5 现代临床黄褐斑外用方剂中核心药物组合

2.3 药物-疾病交集靶点 筛选后得到核心药物靶点347 个，黄褐斑疾病靶点476 个，将药物靶点与疾病靶点匹配后得到18 个交集靶点基因如PTGS2、ESR1、NOS2，见表6。

表6 12 味核心药物与疾病黄褐斑的18 个交集靶点

2.4 疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分网络构建 对18 个交集靶点进行富集分析，得到GO富集46 个，KEGG 通路19 条。GO 富集结果显示，核心药物-黄褐斑-基因的生物功能显著富集在核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性、类固醇结合等方面，根据显著性程度排序，取前20 进行部分展示，见图3。KEGG 富集结果显示，与黄褐斑相关靶点的主要富集在小细胞肺癌、视黄醇代谢、化学致癌作用、甲状旁腺激素的合成分泌和影响等信号通路，提示核心药物可能是通过上述通路影响黄褐斑的治疗效果，见图4。

图3 疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分GO 功能富集分析

图4 疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分KEGG 通路富集分析

运用Cytoscape 3.7.2 构建“疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分”网络，见图5。图中共包含276 个节点（1 个深红色节点代表疾病，18 个紫色节点代表交集靶点，19 个黄色节点代表疾病相关通路，12 个绿色节点代表核心药物，22 个粉红色节点代表各药物之间重复活性成分，编号为A1～R1，204个黄色系节点代表药物活性成分，且颜色由浅到深，不同颜色对应不同的药物）和879 条边，每条边代表潜在活性成分与作用靶点之间有相互作用关系。药物-疾病交集靶点中与有效成分联系密切的有PTGS2、PGR、ESR1、NOS2 和AR 等，见图5。

图5 疾病-交集靶点-通路-核心药物-有效成分网络图

3 讨论

黄褐斑色素沉着主要与黑色素合成增多、黑色素细胞数量增加以及黑色素分布相关[9]。现代医学研究表明，黄褐斑的病因主要与遗传易感性、紫外线辐射、性激素、甲状腺疾病及炎性反应等方面相关[10]。目前中医药调控黄褐斑的作用机制研究主要涉及抑制黑色素、抗氧化、改善局部微循环等方面[11-12]。

中医治疗黄褐斑主要以理气活血、活血化瘀和祛瘀通络为法，本研究使用k 均值聚类算法与回归模型对治疗黄褐斑的药物进行聚类分析，归纳出4个类方组合，第一类：白芷、茯苓、当归和白及；第二类：白芷、白附子、白及和僵蚕；第三类：当归、川芎、白芷和白及；第四类：桃仁、白芷、当归和僵蚕。白芷辛温解表，茯苓利水渗湿，白术益气燥湿，当归补血活血，川芎活血行气，桃仁、白及活血化瘀，白附子解毒散结，僵蚕化痰通络。通过聚类分析可见各类方药组合虽功效有所不用，但都包含了活血化瘀、益气行气及化痰祛瘀之品，为中医临床治疗黄褐斑提供了一定的参考。

本研究基于关联规则获取的12 种核心药物主要为活血化瘀类、平肝息风类、补虚类药物，在药理作用上，白芷、茯苓、白术、白蔹和白附子中有效成分可抑制酪氨酸酶（TYR）活性，从而抑制黑色素生成，淡化色斑；川芎、当归、红花和白附子可活血化瘀，通过促进外周血管扩张、增加血流量、抑制血小板活性聚集等作用，改善局部微循环；丹参和僵蚕还可降低血液黏稠度，改善局部血管淤血状态；白蔹、白及和珍珠中有效成分有抗氧化活性，可有效清除自由基，从而减少色素沉着的产生。

现代研究表明，L-酪氨酸作为黑色素生成的原始底物，经TYR 催化形成多巴，并经过多层反应形成黑色素，因此TYR 在黑色素生成过程起限速作用[13]，其表达和活性影响黑色素生成的速度与产量。视黄酸可降低TYP 和酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）的表达，并通过逆转紫外线刺激对TRP-2 的抑制作用，进而抑制黑色素生成，在此过程中对TYR 活性进行双向调节[14]。同时视黄酮，即视黄醇结合蛋白，诱导皮肤角质层和渗透性屏障的改变也可能促进表皮渗透，增加生物利用度，从而影响色素沉着的发生。本研究中与视黄醇相关的靶点及通路类视黄醇X 受体α（RXRA）、类视黄醇X 受体β（RXRB）、类视黄醇X 受体γ（RXRG）、视黄醇代谢与相关研究有一致相关性[15]。

现代研究表明，环磷酸腺苷（cAMP）依赖信号通路、Wnt 依赖信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是黑色素生成的重要相关通路[16]。本次研究得到的交集靶环氧合酶-2（COX-2）[15]、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）[18]可通过调控α-促黑色素细胞激素（α-MSH）的表达从而上调cAMP，激活环磷腺苷效应元件结合蛋白1（CREB1）的转录。α-MSH 是cAMP 依赖信号通路中的重要上游因子，可调控黑色素的生成。CREB1 是环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的重要亚型，cAMP 通路中磷酸化的CREB 可诱导下游小眼畸形相关转录因子（MITF）的表达，促进黑色素生成[19]。黑色素表达通路中α-MSH、CREB 与下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT 轴）之间有相互作用[20]，HPT 轴中瘦素激活原阿黑皮素（POMC）基因表达衍生的α-MSH 成为间接调节TRH 表达的候选基因。同时，异源细胞系统体外研究表明，α-MSH 通过黑皮质素受体-4（MC4-Rs）传导后经过CREB 的磷酸化和结合可激活促甲状腺激素释放激素（TRH）启动子[21]。本研究结果中的甲状旁腺激素的合成，分泌和作用通路（Parathyroid hormone synthesis，secretion and action）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）、甲状腺癌通路（Thyroid cancer）与HPT 轴相关，这与现有研究中黄褐斑与甲状腺疾病的相关性相印证，但甲状腺激素和甲状腺自身免疫对黄褐斑发病机制的具体影响作用有待进一步证实[22]。

黄褐斑皮损区可伴有不同程度的炎性反应，黑色素细胞作为吞噬细胞可产生不同量黑色素应对表皮炎性反应[23]。同时可通过自分泌或旁分泌的方式产生炎性因子作用于角质形成细胞。而炎性反应可上调POMCmRNA、POMC 多肽和MSH 受体水平[24]，诱导黑色素细胞产生NO，刺激TYR 活性，促进黑色素合成[25]。微阵列分析证明在黄褐斑病变皮肤中PPAR 信号通路的基因下调[26]，激活PPAR 可竞争抑制炎性反应信号通路和炎性介质的生成，本研究中预测的PPAR 信号通路与研究相一致[27]。

在黑色素分布过程中，角质形成细胞中的黑色素小体数量是导致皮肤色素沉着差异的主要原因。相关研究表明，精氨酸酶2（ARG2）可刺激细胞衰老、减少角质形成细胞的自噬、减少黑色素体的转移和降解从而导致皮肤色素沉着[28]。紫外线刺激可上调角质形成细胞中磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核转录因子-κB（NF-κB）通路及一氧化氮/吸入一氧化氮（NO/iNO）信号通路产生NO，在旁分泌模式下刺激TYR 活性，促进黑色素合成[29]。雌激素（ESR）、孕激素（PROG）等卵巢激素也可刺激PI3K/Akt 和NF-κB 通路，导致诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达升高和NO 产生，刺激角质形成细胞和黑色素细胞的增殖。同时，雌激素与黑色素细胞及角质形成细胞上的受体结合可提高cAMP 水平并上调TYR、MITF，诱导黑色素生成[30]。研究表明，男性患者服用抗雄激素非那雄胺后由于雄激素受刺激一定程度上提高了黄褐斑患病率，进一步印证了性激素对黄褐斑发病机制的影响，同时提示黄褐斑发病率女性高于男性可能与卵巢激素刺激iNOS基因表达促进UV 诱导的致病过程相关[31]。本研究中预测的ARG2 及性激素相关靶点雄激素受体（AR）、雌激素受体1（ESR1）、ESR2、参与雌激素合成的酶（CYP1A1）、孕酮受体（PGR）及信号通路雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、类固醇激素合成（Steroid hormone biosynthesis）、卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis）与相关研究相一致[32]。

本研究通过对现代临床研究中基于古方的黄褐斑外用方剂进行数据挖掘分析，获取12 味核心药物，了解其用药规律及作用机制，为其外用治疗黄褐斑的有效性提供了部分分子层面依据，为临床黄褐斑中医外治疗法提供根据及思路。本研究尚存在不足之处，后续研究可将药物的剂量与剂型因素纳入分析，依据本研究进一步分析与优化，进而制定黄褐斑中医外治方剂并进行临床验证，以有效提高中医外治黄褐斑临床疗效。