孤独症谱系障碍患儿血清甘丙肽、神经丝轻链水平与病情严重程度的相关性研究

邹 丹,刘海莲,黄美容,杨 帆,杜国平

(1.重庆市开州区人民医院儿童保健中心,重庆 405400;2.重庆市綦江区人民医院儿科,重庆 401420)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一种神经发育障碍,发病起始于婴幼儿,临床特征为社交障碍或受限、刻板行为、言语发育障碍、兴趣狭隘等,严重影响患儿生长发育和日常生活[1]。世界卫生组织估计全球约有0.76%的儿童患有ASD,随着诊疗技术的不断提高,ASD患病率也在不断增加。美国疾病控制与预防中心数据显示自2002年至2014年8岁儿童ASD患病率从0.66%增加至1.68%[2],Zhou[3]于2014年至2016年在上海、广州、长沙和哈尔滨抽样调查显示6～12岁儿童ASD的患病率为0.70%。早期神经元损伤是ASD发病的基础,在ASD小鼠模型中可观察到星形胶质细胞线粒体损伤、炎症小体激活及其介导的神经细胞凋亡和再生障碍[4]。甘丙肽(galanin,GAL)是中枢和外周神经系统中神经传递的调节剂,Xu等[5]研究发现给予外源性GAL可激活GAL受体促使神经再生。神经丝轻链(neurofilament light chain,NfL)是轴突细胞骨架的神经元特异性成分,可在轴突损伤或神经元细胞凋亡后进入细胞外空间,被认为是一种神经退行性生物标志物[6]。GAL、NfL是否与ASD有关尚不清楚,本研究拟检测ASD患儿血清GAL、NfL水平,分析其与ASD病情的关系,以期为临床ASD诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020年10月至2022年10月重庆市开州区人民医院收治的80例ASD患儿为ASD组。纳入标准:①符合美国精神病学协会的精神疾病诊断和统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,DSM)-5诊断标准[7];②患儿家属或法定监护人知情同意签署同意书。排除标准:①慢性肾脏、内分泌、心脏和肝脏疾病;②代谢障碍,如血脂异常、丙酮酸羧化酶缺乏或卟啉症;③合并儿童期精神分裂症、躁郁症、强迫症或神经衰弱;④营养不良、急性感染、遗传疾病。另选择同期本院儿科保健门诊接诊的62例年龄和性别匹配的健康儿童为对照组,对照组不存在任何精神障碍/行为及系统性疾病。ASD组男56例,女24例;年龄2～8岁,平均(5.16±1.75)岁;体质量指数(body mass index,BMI)21～25kg/m2,平均(22.35±1.49)kg/m2。对照组男41例,女21例;年龄2～9岁,平均(5.12±1.68)岁;BMI 20～25kg/m2,平均(22.16±1.29)kg/m2。两组年龄、性别、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05),本研究方案均根据《赫尔辛基宣言》执行,已经获得我院伦理委员会批准。

1.2 血清GAL、NfL检测

研究对象入组次日晨采集空腹10～12h外周静脉血5mL注入一次性真空采血管,待血液标本凝结取上层液,以3 000rpm离心10min(离心半径10cm),-80℃保存。采用VarioskanLUX酶标仪(美国赛默飞公司),酶联免疫吸附试验检测血清GAL水平,GAL试剂盒购自武汉赛培生物科技公司。GAL检测范围12.35～1 000pg/mL,批内和批间变异系数均控制在10%以内。采用全自动Simoa HD-1蛋白质检测分析仪(美国Quanterix公司),单分子免疫阵列检测技术检测血清NfL水平,NfL试剂盒购自上海舒话生物科技公司。NfL检测范围为0～2 000pg/mL。由对患者临床资料完全不知情的检验科医师操作,批内和批间变异系数均控制在10%以内。

1.3 ASD病情评估

儿童自闭症评估量表(Childhood Autism Rating Scale,CARS)评估病情严重程度[8],CARS包括人际关系、模仿、情感反应、躯体运动能力、与非生命物体的关系、对环境变化的适应、视觉反应、听觉反应、近处感觉反应、焦虑反应、语言交流、非语言交流、活动水平、智力功能、总印象共15个项目进行评估,每个项目采用1～4分4级评分法,满分15～60分。CARS总分<30分为无ASD,30～36分为轻中度ASD,37～60分为重度ASD。根据CARS评分将ASD患儿分为轻中度组和重度组。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ASD组和对照组血清GAL、NfL水平比较

53例患儿于3岁前诊断出ASD,27例于3岁后诊断出ASD,21例有ASD家族史。CARS评分30～53分,平均(36.22±5.91)分。44例(55.00%)为轻中度ASD,36例(45.00%)为重度ASD。ASD组血清GAL、NfL水平均高于对照组,差异有统计学意义(t值分别为29.926、25.029,P<0.05),见表1。

表1 ASD组和对照组血清GAL、NfL水平比较

2.2 不同ASD病情患儿血清GAL、NfL水平比较

重度组血清GAL、NfL水平均高于轻中度组,差异有统计学意义(t值分别为5.053、5.602,P<0.05),见表2。

表2 不同ASD病情患儿血清GAL、NfL水平比较

2.3 血清GAL、NfL水平与CARS评分的相关性

ASD患儿血清GAL、NfL水平与CARS参数人际关系、情感反应、对环境变化的适应、焦虑反应、语言交流、非语言交流、活动水平、CARS总分呈正相关性,差异有统计学意义(r值介于0.241～0.698之间,P<0.05),见表3。

表3 血清GAL、NfL水平与CARS评分的相关系数

2.4 GAL、NfL诊断ASD的价值分析

GAL、NfL诊断ASD的曲线下面积分别为0.736、0.796,联合GAL和NfL诊断ASD的曲线下面积为0.884,经De Long Z检验显示联合诊断大于单独GAL和NfL的诊断效能(Z值分别为3.323、2.402,P<0.05),见表4和图1。

图1 GAL、NfL诊断ASD的ROC曲线

3 讨论

3.1 探寻ASD生物学标志物的必要性

ASD是遗传和环境因素共同作用的结果,其中环境危险因素包括高龄产妇(≥40岁)、父亲年龄较大(≥50岁)、妊娠期间母体代谢异常、肥胖、高血压、细菌或病毒感染、自身免疫性疾病家族史、早产、低出生体重、小于胎龄儿或大于胎龄儿等[9]。ASD患儿多伴发育迟缓或智力障碍、语言和运动障碍及不同形式的焦虑(包括社交焦虑、广泛性焦虑、年幼儿童的分离焦虑和恐惧症),还可引起睡眠障碍、肥胖、癫痫等[9]。ASD确切病因尚不完全清楚,目前认为可能与遗传、环境和免疫因素等有关,上述因素共同作用下引起的神经系统损伤是ASD发病的主要病理基础[10],因此探讨神经损伤相关生物学标志物可能对ASD诊断及病情评估有益。

3.2 GAL与ASD的关系分析

GAL是一种神经肽,由29个氨基酸组成,广泛分布于中枢神经系统及脊髓各节段神经细胞中。GAL受体GAL1主要存在于嗅觉系统、杏仁核、下丘脑、丘脑和脑干,GAL2主要表达于海马、三叉神经束、齿状回和迷走神经背侧复合体,GAL3仅在下丘脑中存在。GAL具有调节胃肠、泌尿生殖系统平滑肌收缩,抑制胰岛素分泌、促使催产素、垂体生长激素释放等功能,GAL还能抑制脊髓神经刺激引起的伤害性反射,增强吗啡脊髓镇痛效果。与其他神经肽一样,GAL可与去甲肾上腺素、5-羟色胺、乙酰胆碱等多种神经递质共同存在于同一神经细胞内,并与其相互作用,参与学习记忆的调节,与癫痫、焦虑症、重度抑郁症、阿尔茨海默病等多种神经精神疾病有关[11-12]。既往研究显示在抑郁、神经元损伤和神经退行性病变中均可观察到GAL异常表达[13-14]。本研究发现ASD组患儿血清GAL水平显著高于对照组,血清GAL水平与ASD患儿CARS评分呈正相关性,GAL诊断ASD的曲线下面积达0.736。Saad等[15]发现ASD儿童血清GAL浓度显著增加,且严重ASD患儿GAL水平明显高于轻症患儿,提示GAL可能在ASD发病机制中发挥一定作用,与病情严重程度有关。但是GAL参与ASD的作用机制尚不清楚,推测可能为ASD发病与γ-氨基丁酸紊乱有关,γ-氨基丁酸可使突触后膜氯离子通道开放,氯离子进入细胞内降低突触后膜负电位,抑制突触后神经元兴奋,γ-氨基丁酸异常可导致神经元兴奋/抑制平衡被破坏,引起神经发育障碍[16]。Bajo等[17]发现GAL对γ-氨基丁酸的传递具有双重作用,可降低大多数中央杏仁核神经元中γ-氨基丁酸能抑制性突触后电位的幅度,并增加其他神经元的γ-氨基丁酸能抑制性突触后电位的幅度,导致压力和焦虑等异常行为和神经发育障碍。

3.3 NfL与ASD的关系分析

神经丝是高度磷酸化的神经元细胞骨架成分,可维持神经元结构并确定轴突口径,根据其分子量,由轻链(NfL)、中链(NfM)和重链(NfH)组成。NfL在神经元细胞体中合成和组装后,通过微管装置沿轴突双向运输,形成与轴突平行的连续重叠阵列,并保持数月至数年内稳定状态,以抵抗外部压力,维持轴突直径,间接调节轴突传导速度[18]。在轴突损伤刺激下,68-kDa的NfL被释放到细胞外液并进入脑脊液、体液及外周血循环,脑脊液NfL水平增高可反映多发性硬化症、神经退行性痴呆、帕金森等多种神经系统疾病的轴突损伤[19]。本研究发现NfL与ASD也存在密切关系,ASD组血清NfL水平高于对照组,NfL与CARS评分正相关,诊断ASD的曲线下面积为0.796,表明NfL可作为ASD的生物学标志物。Ameis等[20]研究发现大脑边缘系统整合负责复杂社会情绪功能的调节,大脑边缘连接发育受损影响白质和髓鞘形成,导致ASD社交障碍。边缘密度成像检查显示ASD患儿白质束连接边缘密度显著降低,表明白质连接不足是ASD的潜在机制[21]。Bergman等[22]研究发现NfL是白质损伤的敏感和特异性标志物,因此推测ASD患者血清NfL升高可能由白质连接发育受损引起,NfL不仅是ASD的症状性标志物,也可能参与ASD的病理生理过程。ROC分析结果显示联合GAL和NfL后诊断ASD的曲线下面积较单独诊断明显增大,提示联合检测血清GAL和NfL可为ASD诊断提供更可靠的信息。

综上,ASD患者血清GAL和NfL水平均增高,高GAL和NfL与ASD病情严重程度有关,联合GAL和NfL在ASD诊断中具有较高的价值。本研究创新性在于验证了GAL、NfL和ASD病情可能存在相关性,GAL、NfL有望成为ASD的有价值生物标志物,可能为未来开展ASD发病机制和临床治疗提供参考和靶点。本研究不足之处在于样本量偏少,可能导致统计学偏倚,尚需进一步扩大样本数量加以证实。