哮喘儿童TLR4基因多态性与其外周血炎症因子及肺功能水平的相关性研究

王字卉,李权伦,散 琴

(湖北省十堰市妇幼保健院检验科,湖北 十堰 442000)

支气管哮喘是涉及多种细胞和炎性因子参与的以气道慢性炎症为特征的疾病,这种慢性炎症与气道高反应性相关[1-3]。据不完全统计我国的儿童哮喘患病率呈逐年增长的趋势,哮喘不仅影响青少年儿童的发育和身体健康,而且影响儿童的心理健康,因此有效的预防和早期的诊疗,对减少儿童哮喘的发生具有重要意义[4-5]。研究显示哮喘的发生发展与多个基因和环境因素密切相关[6-8],Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)为单个的跨膜蛋白,能够识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[9-11],作为Toll样受体家族成员之一的TLR4近年来受到研究者的广泛关注。TLR4能够识别细菌细胞壁中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),并可调节Th1/Th2的平衡,影响体内白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平[12-13],其与哮喘的发生发展密切相关,但TLR4基因多态性与儿童哮喘及患儿病情预后之间的关联尚不明确,本研究旨在探索哮喘儿童外周血IL-4和IFN-γ水平及其与Toll样受体4基因多态性的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2019年4月至2022年10月湖北省十堰市妇幼保健院收治的172例急性发作期哮喘患儿为实验组,纳入标准:①年龄为6～14周岁;②诊断标准按照2020版《儿童支气管哮喘规范化诊治建议》[14];③无心肺、肝脏、肾脏等器官的功能障碍;④无其他自身免疫缺陷症疾病或者先天性疾病。根据患儿哮喘的严重程度,将实验组分为轻度、中度、重度和危重。选择同期在本院儿童保健科门诊体检的136例儿童作为对照组,研究对象均为汉族人群。本研究通过十堰市妇幼保健院伦理委员会审查,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂及材料

IL-4、IFN-γ测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,DNA提取试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司,低温离心机购自Thermo Scientific公司,PCR仪购自Bio-Rad公司,DYY-6C电泳仪购自北京六一仪器厂,引物设计及合成购自上海生工生物工程公司,凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,血细胞分析仪为深圳迈瑞公司,NO分析仪购自江苏无锡尚沃公司。

1.3 研究方法

1.3.1 标本的采集及处理

收集纳入患者的年龄、性别、体质量指数(body mass index,BMI)等一般资料,于患者入院24h内采集患者外周血3mL于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)真空抗凝管,混匀,离心(3 000r/min)10min,分离血浆和细胞,-80℃低温冰箱保存备用。

1.3.2 各项临床指标检测

采用酶联免疫吸附法测定血浆中的IL-4、IFN-γ水平,测定的方法严格按照碧云天公司产品试剂盒说明书进行操作,利用血细胞分析仪测定外周血嗜酸性粒细胞百分比(eosinophils,Eos),利用化学发光法检测血清总免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE),利用便携式肺功能仪和NO分析仪,指导受试者进行肺功能指标一秒率(forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity,FEV1/FVC)和呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)测定,共测定3次,取最佳值。

1.3.3 TLR4基因多态性的测定

按照DNA提取试剂盒说明书操作规程,快速抽提全血基因组DNA,检测样本吸光度值A260/A280介于1.6～1.8,将提取的样本DNA于-80℃低温冰箱保存,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction,PCR-RELP)技术对TLR4基因多态性的检测分析,上下游引物见表1。PCR扩增条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,循环30次,之后72℃延伸5min。PCR扩增产物用限制性内切酶进行酶切,酶切产物在3.5%的琼脂糖凝胶上电泳,然后通过Bio-Rad凝胶成像系统观察结果,判断样本的基因型。

表1 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile上下游引物

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组一般资料比较

实验组、对照组在性别、年龄、BMI方面比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 各组间一般资料比较

2.2 对照组和实验组临床相关指标比较

实验组哮喘患儿外周血中IL-4、Eos、IgE、FeNO的水平高于对照组,而IFN-γ、FEV1/FVC(%)水平低于对照组,差异均有统计学意义(t值介于8.90～29.04之间,P<0.05),见表3。

表3 对照组和实验组临床相关指标比较

2.3 TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点单核苷酸多态性遗传平衡检验

TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile位点单核苷酸多态性的预期基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),样本具有群体代表性;实验组与对照组TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因分布相比,差异不具有统计学意义(P>0.05);实验组Thr399Ile单核苷酸多态性位点TT基因型分布频率高于对照组,T等位基因分布频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2值分别为10.19、11.50,P<0.05),见表4。TLR4基因Thr399Ile位点PCR-RFLP电泳图谱(29bp条带在琼脂糖凝胶电泳中未能显示出)见图1。

注:Lane1、Lane4为CC基因型(406bp);Lane2为CT基因型(406bp、377bp、29bp);Lane3、Lane5为TT基因型(377bp、29bp);29bp条带在琼脂糖凝胶电泳中未能显示出。

表4 各组TLR4基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验及分布频率的比较 [n(%)]

2.4 TLR4基因Thr399Ile多态性和哮喘患儿临床相关指标比较

携带Thr399Ile TT基因型哮喘患儿的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平低于CC和CT基因型,差异有统计学意义(F值分别为44.95、24.29、8.51,P<0.05);TLR4基因Thr399Ile多态性与哮喘患儿Eos、IgE的水平、FEV1/FVC(%)无相关性(P>0.05),见表5。

表5 TLR4基因Thr399Ile多态性和儿童哮喘临床相关指标比较

2.5 TLR4基因Thr399Ile多态性和患儿哮喘严重程度比较

秩和检验显示携带Thr399Ile 单核苷酸多态性位点基因型与哮喘发病程度不相关,差异无统计学意义(P>0.05),见表6。

表6 TLR4基因Thr399Ile多态性和患儿哮喘严重程度比较 [n(%)]

2.6 二元Logistic回归分析TLR4基因Thr399Ile位点的单倍体基因型与儿童哮喘的相关性

共显性模型中,TT基因型人群是CC型人群患病风险的2.353倍,其OR值及95%CI为2.353(1.575～4.663),P<0.05;显性模型中,CT+TT基因型人群是CC型人群患病风险的1.962倍,其OR值及95%CI为1.962(1.228～3.206),P<0.05;隐形模型中,TT基因型人群是CC+CT型人群患病风险1.875倍,其OR值及95%CI为1.875(1.258～3.059),P<0.05,见表7。

表7 二元Logistic回归分析TLR4基因Thr399Ile位点与儿童哮喘的关系

3 讨论

3.1 儿童哮喘的致病机理

哮喘是儿童比较常见的疾病之一,主要与遗传和环境因素相关,是受多个基因调控而引起的免疫功能紊乱的气道高反应炎症,研究表明哮喘患儿体内的细胞因子和免疫细胞水平异常,是Th1/Th2比例失衡导致的2型炎症[15-16]。TLR是模式识别受体的一种,TLR具有单个的跨膜蛋白,可识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子。作为Toll样受体家族成员之一的TLR4近年来受到研究者的广泛关注。有研究表明,TLR4途径可触发NF-κB信号通路的活化,影响基因表达的调控,进而影响机体的炎症因子和免疫细胞水平[17-18]。因此,本研究旨在探索哮喘儿童外周血IL-4和IFN-γ水平及其与Toll样受体4基因多态性的相关性,为儿童哮喘的诊疗提供新的思路。

3.2 哮喘患儿外周血炎症因子及肺功能水平分析

本研究选取172例哮喘患儿进行了分析,研究结果显示,哮喘组患儿外周血中IL-4水平升高,IFN-γ水平降低,而IL-4主要由Th2淋巴细胞释放,IFN-γ主要由Th1淋巴细胞释放,说明哮喘患儿是机体内的Th1/Th2比例失衡导致的2型炎症。此外,哮喘组患儿肺功能指标FEV1/FVC(%)显著低于对照组,FeNO水平显著高于对照组。FeNO是气道上皮细胞及炎症细胞的一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生的,当气道受外界刺激诱发2型炎症时,可导致气道上皮细胞中一氧化氮合酶表达增多,从而催化L-精氨酸产生更多的NO;是目前被广泛认可的气道2型炎症的分子标志物,其不仅能反映气道炎症水平,还能预测评估抗炎效果。该检测具有无创简便的优点,在临床上得到了广泛的应用[19]。

3.3 哮喘患儿与TLR4基因多态性的相关性分析

通过进一步研究发现,TLR4基因Thr399Ile多态性与哮喘患儿外周血嗜酸性粒细胞百分比、IgE的水平、FEV1/FVC(%)无相关性,但携带Thr399Ile TT基因型哮喘患儿的IL-4和FeNO水平高于CC和CT基因型,IFN-γ的水平显著低于CC和CT基因型。TLR4基因、IL-4、IFN-γ可能是哮喘轻症进展成重症的关键因子,FeNO水平可预测哮喘的严重程度。基因水平检测发现,TLR4基因多态性位点Asp299Gly的基因型和等位基因分布差异不明显,Thr399Ile的基因型和等位基因分布存在显著差异,其中实验组T等位基因分布频率显著高于对照组。二元Logistic回归分析发现TLR4基因Thr399Ile位点的基因多态性与儿童哮喘存在相关性,TT基因型是儿童哮喘的独立危险因素。但本研究纳入样本量较小,且并未进行多因素的分层分析,因此后续我们还需进一步扩大样本量,同时进一步探索不同因素对TLR4基因多态性与儿童哮喘相关性的影响。

综上所述,本研究发现TLR4基因Thr399Ile位点多态性与儿童哮喘的发生具有相关性,影响哮喘患儿IL-4、IFN-γ、FeNO的表达水平,但与哮喘患儿的肺功能水平和发病的严重程度无关。