PD-1溶瘤病毒对小鼠卵巢癌的抗肿瘤活性

唐国玲 黄山鹰 刘剀 胡海燕 曾薇薇 苏圣梅 阎恺

(南方医科大学附属深圳妇幼保健院妇科,广东 深圳 518000)

卵巢癌发病初期无特异性症状,约2/3的患者就诊时已达到国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期,手术治疗效果不佳,需要联合术后化疗,对顺铂、紫杉醇等化疗药物耐药性增加时不良预后的主要原因之一〔1〕。程序性细胞死亡蛋白(PD)-1与其配体结合后能够抑制T细胞活性,诱发肿瘤免疫逃逸〔2〕;PD-1抗体能够降低PD-1活性,提高免疫细胞的抗肿瘤作用;但由于PD-1抗体的组织穿透性较差,难以达到肿瘤病灶处,降低了其疗效〔3〕。溶瘤病毒具有抗癌作用的同时还能够增强活化T细胞浸润,与抗PD-1抗体结合后可提高其组织穿透性,增强抗肿瘤作用〔4〕。本研究探讨PD-1溶瘤病毒对卵巢癌的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂 SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体质量(20±2)g,购于上海交通大学医学院实验动物中心,许可证号:SYXK(沪)2023-0007。人卵巢癌SKOV-3细胞株购于上海昆盟生物科技有限公司。PD-1、溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)购买以及PD-1溶瘤病毒构建由上海和元生物技术有限公司完成。DMEM细胞培养基、胎牛血清购于青岛捷世康生物科技有限公司;淋巴细胞分离液、PE标记小鼠抗人CD4单克隆抗体、PE标记小鼠抗人CD8单克隆抗体均购于天津梅德生物科技有限公司;酶联免疫检测试剂盒〔白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ〕均购于仁捷(上海)生物科技有限公司;免疫组化(SP)检测试剂盒(P53、Ki67)购于北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2造模及PD-1溶瘤病毒最佳滴度筛选 复苏人卵巢癌SKOV-3细胞株后使用含胎牛血清的DMEM细胞培养基培养、传代,调整细胞密度为1×107/ml,向小鼠右前腋下注射0.2 ml细胞悬液,继续培养14 d后筛选出现移植瘤的小鼠进行后续研究。为筛选PD-1溶瘤病毒最佳滴度,分别将滴度为5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108的PD-1溶瘤病毒注射入卵巢癌肿瘤内部,每个滴度5只小鼠,同时设置5只小鼠为空白对照。每2 d注射1次,注射3次,末次注射结束后继续培养7 d,测量肿瘤长径、短径,计算卵巢癌肿瘤体积。

1.3分组与肿瘤体积测量 取卵巢癌造模成功的小鼠64只,随机分为模型组(静脉注射等量生理盐水),PD-1抗体组(静脉注射PD-1单克隆抗体,200 μg),单独溶瘤病毒组(瘤内注射oHSV病毒,滴度5×107),PD-1溶瘤病毒组(瘤内注射PD-1溶瘤病毒,PD-1溶瘤病毒),每组16只。同时设置对照组(正常喂养的小鼠,静脉注射等量生理盐水)16只。每2 d注射1次,注射3次,末次注射结束后继续培养7 d,测量肿瘤长径、短径,计算卵巢癌肿瘤体积。

1.4标本采集与处理 测量完肿瘤长径、短径后麻醉小鼠并称重,腹主动脉取血后处死小鼠,剪下肿瘤组织并称重,记录肿瘤质量;取出脾脏、胸腺并称重,计算脾指数、胸腺指数。将收集的部分血液标本离心处理,-80 ℃保存待测;另外一部分血液标本放于适量的红细胞裂解液中,得到外周血T淋巴细胞,磷酸缓冲液重悬、混合均匀后计数备用。将肿瘤组织常规制成石蜡切片,用于免疫组化检测。

1.5各组小鼠T淋巴细胞亚群检测 取各组小鼠的外周血T淋巴细胞约1×107个,配制成500 μl的细胞悬液,分别加入PE标记小鼠抗人CD4单克隆抗体、PE标记小鼠抗人CD8单克隆抗体后混合均匀,避光静置30 min,离心后弃去沉淀,磷酸缓冲液重悬后上流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,记录CD4+、CD8+比例,计算CD4+/CD8+比值。

1.6各组小鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ浓度检测 取各组小鼠-80 ℃保存的血清样本,复温后吸出0.3 ml,按试剂盒说明书中的步骤,酶联免疫吸附法测定血清IL-2、IL-10、IFN-γ浓度。

1.7SP法检测各组小鼠P53、Ki67表达检测 取肿瘤组织石蜡切片,烤片30 min,二甲苯浸泡后梯度浓度的酒精脱水,过氧化氢去除内源性过氧化物酶活性,修复抗原后封闭非特异性抗原;滴加一抗:鼠抗人P53单克隆抗体(1∶1 000倍稀释),鼠抗人Ki67单克隆抗体(1∶500倍稀释),鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶4 000倍稀释),室温下孵育1 h,滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗属IgG(1∶4 000倍稀释),显色、复染、脱水、透明后封片。显微镜下随机计数200个细胞,计算阳性细胞比例,根据阳性细胞比例和染色强度进行评分,使用两者的乘积判定结果,阴性(0分)、弱阳性(1～2分)、中等阳性(3～4分)、强阳性(>4分),将中等阳性和强阳性记为阳性。

1.8统计学分析 采用SPSS25.0软件进行χ2检验、方差分析,组间两两比较进行LSD-t检验。

2 结 果

2.1不同滴度PD-1溶瘤病毒对肿瘤体积的影响 PD-1溶瘤病毒滴度0、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108时肿瘤体积依次为(308.51±12.80)、(269.83±15.65)、(236.24±11.97)、(213.69±9.41)、(189.47±8.29)、(173.59±7.85)、(171.06±8.53)mm3。不同PD-1溶瘤病毒滴度的卵巢癌小鼠之间肿瘤体积比较差异有统计学意义(F=30.958,P=0.000);随着PD-1溶瘤病毒滴度的升高肿瘤体积逐渐降低。当PD-1溶瘤病毒滴度达到5×107时卵巢癌小鼠肿瘤体积不再明显降低,与1×108时肿瘤体积之间比较差异无统计学意义(P>0.05),因此后续实验以PD-1溶瘤病毒滴度5×107处理卵巢癌小鼠。

2.2各组肿瘤体积、肿瘤质量比较 各组肿瘤体积、肿瘤质量比较差异有统计学意义(P<0.001);模型组肿瘤体积、肿瘤质量明显高于对照组(P<0.05),PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组肿瘤体积、肿瘤质量明显低于模型组,PD-1溶瘤病毒组肿瘤体积、肿瘤质量明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(均P<0.05)。见表1。

2.3各组脾脏指数、胸腺指数水平比较 各组脾脏指数、胸腺指数比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组脾脏指数、胸腺指数明显低于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组脾脏指数、胸腺指数明显高于模型组,PD-1溶瘤病毒组脾脏指数、胸腺指数明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表1。

2.4各组T淋巴细胞亚群比较 各组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组CD4+、CD4+/CD8+明显低于对照组,CD8+明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组CD4+、CD4+/CD8+明显高于模型组,CD8+明显低于模型组(P<0.05);PD-1溶瘤病毒组CD4+、CD4+/CD8+明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组,CD8+明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表1。

表1 各组肿瘤体积、肿瘤质量、脾脏指数、胸腺指数水平、T细胞浸润水平比较(n=16)

2.5各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平比较 各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组血清IL-2、IFN-γ明显低于对照组,IL-10明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组血清IL-2、IFN-γ明显高于模型组,IL-10明显低于模型组;PD-1溶瘤病毒组血清IL-2、IFN-γ明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组,IL-10明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表2。

2.6各组P53、Ki67阳性表达比较 各组P53、Ki67阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组P53、Ki67阳性率明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组P53、Ki67阳性率明显低于模型组;PD-1溶瘤病毒组P53、Ki67阳性率明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平、P53、Ki67阳性表达比较

3 讨 论

卵巢癌发病早期症状隐匿,诊断难度高,导致患者无法得到及时治疗、致死率高。相关研究显示,无盆腔淋巴结转移的卵巢癌患者5年生存率在40%左右,当出现盆腔淋巴结转移后患者的5年生存率下降至10%左右〔5〕。手术难以根治卵巢癌是患者不良预后的主要原因之一,需要联合术后化疗(顺铂、紫杉醇等),但耐药性发生率高,还可能引发外周免疫系统功能抑制〔6〕;因此,探寻新的治疗手段对延长患者的生存时间具有重要意义。本研究结果提示,PD-1抗体、单独溶瘤病毒、PD-1溶瘤病毒干预均能够控制卵巢癌小鼠病情进展,其中PD-1溶瘤病毒效果最明显。

脾脏和胸腺在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用,脾脏指数、胸腺指数减小会导致外周血白细胞比例下降、免疫功能减退,抗肿瘤活性降低〔7,8〕。T淋巴细胞主要包括CD4+、CD8+,在肿瘤免疫微环境中发挥抗肿瘤作用〔9〕。激活T淋巴细胞能够杀灭肿瘤相关的自身抗原,但多数恶性肿瘤患者无法自发激活抗原特异性T淋巴细胞〔10〕。IL-2与IFN-γ具有免疫效应细胞活性,能够提高人体的免疫功能,与免疫治疗效果密切相关〔11〕。IL-10具有免疫抑制作用,其高表达会降低肿瘤免疫治疗效果〔12〕。PD-1是免疫负调控因子,能够抑制免疫系统功能,降低免疫细胞对肿瘤的杀伤活性〔13〕。抗PD-1抗体能够抑制PD-1活性,提高免疫细胞的抗肿瘤作用。但单克隆PD-1抗体组织穿透力较弱,难以到达肿瘤病灶;溶瘤病毒组织穿透力强,在具有抗肿瘤活性的同时还可作为载体工具〔14〕。本研究中通过构建PD-1溶瘤病毒,明显提高了对卵巢癌的免疫调节作用,增强特异性抗肿瘤免疫细胞的杀伤能力,提高疗效。

P53基因是与人体肿瘤相关性最高的基因,引发肿瘤形成和恶性转化的P53蛋白是P53基因突变的产物,发挥肿瘤促进作用,会抵消野生型P53基因的抑癌作用〔15〕。相关研究显示,50%以上高恶性程度的浆液性卵巢癌组织中存在P53突变〔16〕。Ki67阳性表达于细胞核中,与核糖体转录相关,是评估肿瘤细胞活性的指标〔17〕。研究显示,Ki67代表有丝分裂指数,在G0静息期外的循环细胞中均有表达,肿瘤细胞增殖活性的提升说明恶性程度的增加〔18〕。本研究结果提示,PD-1溶瘤病毒可通过下调P53、Ki67表达来抑制卵巢癌的发展,且相比于单独PD-1抗体、溶瘤病毒作用更强。