脂肪酸结合蛋白5结合Vimentin蛋白在肝癌中的作用机制

唐艳萍 李科志 蔡政民 陶昊 唐嘉营 李学宇 李炎娟 曹骥，2

1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 （南宁 530021）；2广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室（南宁 530021）

肝癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，起源于肝脏上皮或间叶组织，具有起病隐匿、进展快和预后差等特点。在我国肿瘤死因中位居第二，并且其发病率目前仍呈上升趋势，严重危害人类生命健康［1］。肝癌的治疗技术不断进步，但肝癌患者的5 年生存率仍不容乐观，主要原因归结于患者发生转移，这是肝癌治疗当前面临的重要挑战。因此，深入研究肝癌转移的分子机制对寻找肝癌治疗的分子靶标具有重要的现实意义和理论价值。脂肪酸结合蛋白5（FABP5）具有癌基因的功能，参与了多种癌症发生和发展的进程。迄今为止，FABP5 在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等多种类型肿瘤中已被证实过表达，并与患者不良预后密切相关［2-5］。本课题组前期证实FABP5 在人肝癌组织中高表达，在肝癌的发生发展过程中起重要作用［6-7］。本研究通过免疫沉淀联合质谱法（IP-MS）筛选出与FABP5 相互结合的潜在靶蛋白，并验证FABP5 与候选互作蛋白的结合作用，同时分析二者的表达关系，以期为肝癌的发病机制研究和靶向治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 肝癌细胞SK-Hep1、HepG2 和人肾上皮细胞293T 为本实验室保藏；DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液、购于美国Gibco 公司；TRIzol 购于Invitrogen 公司；Prime-Script ™ RT reagent Kit（货号：RR037A）和SYBR Premix Ex Taq（货号：RR420A）购于Takara 公司；FITC 标记的鬼笔环肽（货号：40737ES75）购于祤圣生物； RIPA 细胞裂解液、BCA 试剂盒和DAPI 染料购自碧云天公司；抗FABP5兔多克隆抗体（货号：ab84028）购于Abcam 公司；抗Vimentin 兔多克隆抗体（货号：CY5134）、抗Flag 抗体（货号：AB0028）和抗Myc 抗体（货号：AB0001）购于abways 公司；蛋白A 琼脂糖珠（货号：9863S）和Rabbit IgG（货号：2729）购置于CST 公司。

1.2 构建FABP5 过表达或敲低的稳转肝癌细胞株 将Flag-FABP5 和shFABP5 分别构建入慢病毒表达载体。取对数生长期的肝癌细胞以5 × 104/mL的密度接种到6 孔板中，每孔加入10 μL 慢病毒溶液感染SK-Hep1、HepG2 肝癌细胞，同时加入聚凝胺（最终浓度为5 g/mL）。在转染48 h 后，加入2 μg/mL 嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞。

1.3 免疫沉淀与质谱 收集过表达FABP5 的SKHep1 和HepG2 细胞，离心，弃上清，加入细胞IP 缓冲液，冰上裂解细胞30 min，取上清，加入抗FABP5抗体，孵育2 h 后4 ℃过夜，加入带Flag 标签的蛋白A 琼脂糖珠后摇床孵育1 h，离心收集沉淀。用预冷的0.1%PBST 洗涤4 ～ 5 次。加入loading buffer重悬，100 ℃，变性10 min。将得到的样品，包括过表达FABP5 的SK-Hep1 细胞IP 组和过表达FABP5的HepG2 细胞IP 组，送至公司进行Shotgun 法质谱检测。采集质谱数据，将质谱测试原始文件用Proteome Discoverer1.4 软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

1.4 Western blot 用RIPA 裂解液裂解相应的细胞，通过BCA 法测定总蛋白浓度。取30 μg 蛋白样品上样，10% SDS-PAGE 分离蛋白后，将蛋白条带转至PVDF 膜上。PVDF 膜在含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭1 h 后，用相应的一抗在4 ℃下孵育过夜。TBST 洗3 遍后，将膜与二抗在室温下孵育1 h。加ECL 化学发光检测试剂，在化学发光成像仪下拍摄图像。

1.5 免疫共沉淀 分别转染Myc-PRDX1、Myc-PRSS3、Myc-PKM、Myc-HSP90AA1、Myc-Vimentin 和Flag-FABP5 质粒至293T 细胞中，或取SK-hep1 和HepG2 细胞，裂解后将每组细胞分成三部分，一份作为Input 对照，进行SDS-PAGE 电泳，以验证样品的有效性。另外两份分别加入Ig G 抗体和抗FABP5抗体，4 ℃孵育过夜，加入蛋白A琼脂糖珠后摇床孵育1 h，离心收集沉淀。用预冷的0.1%PBST洗涤4 ～ 5 次。加入loading buffer 重悬，100 ℃，变性10 min。分别用抗Myc 和抗Vimentin 抗体进行Western blot 检测。

1.6 qRT-PCR 利用TRIZOL 试剂提取细胞中的总RNA，通过逆转录试剂盒合成cDNA，PCR 反应条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃30 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，mRNA 相对表达量通过2-ΔΔCt计算。引物序列：Vimentin 上游：5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′；下游：5′-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′；GAPDH上游：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.7 免疫荧光实验 使用PBS 清洗细胞2 次，用4%多聚甲醛于室温下固定细胞20 min，然后用PBS 洗涤2 次后，加入FITC 标记的鬼笔环肽后在室温下避光孵育60 min。PBS 洗涤2 次后，DAPI染细胞核10 min，PBS 洗涤2 次，晾干封片，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.8 生物信息学分析 收集质谱筛选出的蛋白，采用R 软件对蛋白进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和KEGG 分析。GO 分析用于了解蛋白富集的生物学进程、表达位置和分子功能三个方面。KEGG 分析用于了解FABP5 结合蛋白参与的相关通路。

1.9 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行数据统计分析，组间比较采用Student′st检验。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IP-MS 分析 本研究首先采用IP-MS 筛选FABP5 的潜在靶蛋白。在SK-Hep1 和HepG2 细胞中稳定过表达FABP5，抗FABP5 抗体对细胞中蛋白进行IP，通过质谱检测鉴定FABP5 作用的靶蛋白。对比过表达FABP5 的SK-hep1 和HepG2 细胞质谱数据，取交集，鉴定出336 个与FABP5 特异结合的蛋白。通过对336 个互作蛋白进行通过GO分析和KEGG pathway 富集分析，发现FABP5 的互作蛋白主要参与翻译、中间纤维合成、角质化等生物过程；存在于外泌体、核糖体、黏着斑等细胞组分；具有结合RNA、结合钙黏蛋白、结合肌动蛋白丝等分子功能；参与核糖体生物发生、病毒细菌感染、肌动蛋白细胞骨架调控、黏着斑形成等通路（图1）。

图1 生物信息学方法分析FABP5 结合蛋白参与的多种细胞功能和信号通路Fig.1 The cellular functions and signaling pathways involved in FABP5 binding proteins analysed by bioinformatics

2.2 免疫共沉淀验证FABP5 与候选互作蛋白的结合关系 结合查阅相关文献，挑选出5 个与肝癌关系密切的候选蛋白，分别为PRDX1、PRSS3、PKM、HSP90AA1 和Vimentin。利用293T 细胞进行外源性Co-IP 实验，验证FABP5 和候选蛋白的相互作用。如图2A 所示依次用Flag 和Myc 标签抗体能将 Flag-FABP5 和Myc-Vimentin 同时沉淀下来，结果证实FABP5 能特异性地结合Vimentin，而与PRDX1，PRSS3，PKM 和HSP90AA1 无相互作用。为了进一步验证FABP5 能否和Vimentin 内源性结合，提取SK-hep1 和HepG2 肝癌细胞的蛋白分别进行了Co-IP 分析。结果证实FABP5 能特异性地结合内源性的Vimentin（图2B）。由此说明无论是在293T 细胞还是在SK-hep1 和HepG2 肝癌细胞中，FABP5 与Vimentin 均相互结合。

图2 Co-IP 法验证 FABP5 与Vimentin 相互作用Fig.2 Co-IP verification results of the interaction between FABP5 and Vimentin.

2.3 FABP5 对Vimentin 表达的调控作用 为分析FABP5 在肝癌中对Vimentin 的调控作用，观察敲低FABP5 基因在转录和翻译层面上对肝癌细胞内Vimentin 表达的影响。结果显示：在SK-Hep1 细胞中敲低FABP5，Vimentin 蛋白的表达显著降低，但Vimentin mRNA 水平未见明显改变。同样，抑制HepG2 细胞中FABP5 基因的表达，也观察到Vimentin 蛋白表达的下调，而Vimentin mRNA 没有显著变化（图3A-B）。同时以SK-hep1 细胞为对象（因HepG2 细胞聚簇性生长，无法进行实验）通过免疫荧光实验进一步验证二者关系。在FABP5 基因被敲低的SK-Hep1 细胞中，观察到红色荧光标记的Vimentin 表达显著降低（图3C）。以上结果提示FABP5 与Vimentin 在肝癌细胞中的表达密切相关，FABP5 在翻译水平上影响vimentin 的表达。

图3 FABP5 对Vimentin 表达的调控作用Fig.3 The regulation of Vimentin expression by FABP5

2.4 FABP5 对细胞骨架的影响 GO 分析的结果提示FABP5 的互作蛋白可能参与肌动蛋白细胞骨架重塑过程，考虑到细胞骨架调节高度参与了上皮间质转化（EMT）过程，与肿瘤发生发展密切相关，因此本研究通过鬼笔环肽染色实验观察FABP5 对细胞骨架的影响（见图4）。用FITC 标记的鬼笔环肽可特异的与细胞的纤维状肌动蛋白（F-actin）结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。免疫荧光实验结果表明：F-actin 呈圆环型密集排列在对照组肝癌细胞周围，这是具有顶端-基底外侧极性的非迁移性细胞特征。而在FABP5 过表达的肝癌细胞中，F-actin 被重新分布成应力纤维，形成细长形状，这是具有前端-后端极性的迁移性细胞特征。由此可见，与对照组相比，过表达FABP5 基因的SK-hep1 肝癌细胞发生了细胞骨架的重塑。

图4 通过鬼笔肽染色法观察FABP5 过表达对肝癌细胞骨架的影响Fig.4 The effect of overexpressing FABP5 on the cytoskeleton of HCC cell was observed by phalloidin staining

3 讨论

FABP5 属于脂肪酸结合蛋白家族中的成员，是来源于表皮细胞并定位于胞浆的高度保守的小分子蛋白质，约15 kD［8］。作为疏水性配体（包括各种维甲酸和长链脂肪酸）的载体，它不仅参与长链脂肪酸的结合、转运、储存和代谢，为细胞的生长提供能量及原材料，还能作为信号分子，影响细胞生长的信号转导等［9］。越来越多的研究证实异常表达的FABP5 通过发挥癌基因作用参与人类癌症的发生和进展。本课题组前期发现FABP5 在人肝癌组织高表达，敲低FABP5 可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭［10］。已知，EMT 能使上皮细胞获得迁移运动的能力，与肿瘤的发生和转移密切相关［11］。有研究［12］报道FABP5 与EMT 标志物E-catenin 的表达在癌变过程中呈正相关。提示FABP5 通过诱导EMT 参与肿瘤的进程。

FABP5 发挥作用的分子基础是蛋白之间的相互作用。LU 等［13］报道FABP5 与脂肪酸合成酶（FASN）之间相互作用，并通过泛素蛋白酶体途径调节FASN 的表达，增加脂滴沉积和激活WNT/β-catenin 信号通路，促进胰腺神经内分泌肿瘤的发生发展。本研究通过IP-MS方法筛选出与FABP5结合蛋白。GO 分析和Pathway 分析结果表明，FABP5 结合蛋白广泛地参与了细胞增殖、迁移、细胞代谢等多个细胞生命活动，与多个细胞信号通路相关。接着从FABP5 候选互作蛋白筛选出5 个分子，通过外源性和内源性Co-IP 实验证实FABP5可以与Vimentin 相互结合。Vimentin 属于一种存在于间充质细胞中的Ⅲ型中间丝蛋白，是连接细胞膜与细胞核的细胞骨架重要组成成分，具有稳定细胞结构、调控细胞的增殖和分化、迁移、影响血管生成和病毒感染等作用，是EMT 的重要标志物［14］。研究［15-17］发现Vimentin 在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中过表达，被认为是肿瘤侵袭和转移的重要指标。已报道多种蛋白质分子可与Vimentin 相互作用，介导EMT 以促进多种恶性肿瘤的侵袭转移。例如CMTM6 与Vimentin 相互作用并增加Vimentin 稳定性，从而通过诱导EMT 促进肝癌细胞迁移和侵袭［18］。MAP2K4 与Vimentin结合，激活PI3K/AKT 信号通路及EMT，上调乳腺癌细胞增殖、迀移和侵袭能力［19］。本研究结果提示FABP5 诱导EMT 可能与Vimentin 的互作有关。

进一步实验明确FABP5 对Vimentin 的调控关系，发现敲低FABP5 并不影响Vimentin 转录水平的表达，但影响Vimentin 的翻译水平的表达，说明FABP5 结合Vimentin 可能通过翻译后机制增强Vimentin 的稳定性。已知Vimentin 翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、糖基化及泛素化等，而泛素化是最为常见的形式［20］。有研究［21］报道FAM171B与Vimentin 结合，通过调节泛素化来影响Vimentin蛋白的稳定性，促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭。因此我们推测FABP5 增加Vimentin 蛋白的稳定性可能与泛素蛋白酶体途径相关。然而，FABP5 调控Vimentin 蛋白表达的具体分子机制尚不清楚，有待进一步研究。

在本研究中，对FABP5 互作蛋白进行GO 和KEGG pathway 富集分析发现FABP5 的互作蛋白具有结合肌动蛋白丝的功能，参与肌动蛋白细胞骨架调控通路。研究［22］表明Vimentin 能通过GEF-H1和RhoA 控制肌动蛋白应力纤维，调节细胞骨架动力学。鉴于FABP5 可结合并调节Vimentin，我们从形态学上观察干预FABP5 对肝癌细胞骨架的影响，发现过表达FABP5 基因的SK-hep1 肝癌细胞发生从顶端-基底极性到前-后极性的转换，细胞骨架发生了改变，说明FABP5 可影响肝癌细胞骨架的重塑过程。研究［23］证实细胞骨架重塑是驱动肝癌细胞发生EMT 的重要因素。在EMT 过程中，上皮细胞骨架发生重组，与基底膜和细胞极性的连接丧失，导致细胞转移能力增加［24］。在乳腺癌细胞中发现Vimentin 能重塑细胞骨架，诱导整合素β1 表达增加，促进EMT 表型［25］。由此推测FABP5 可影响细胞骨架重塑，驱动EMT，从而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，本研究首次研究了FABP5 与Vimentin 互作在肝癌中的关系。结果证实FABP5 可以通过结合和调节Vimentin，促进细胞骨架重塑，从而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。本研究对深入了解肝癌转移的机制具有重要的意义，为肝癌靶向治疗提供了新的方向。然而，本研究存在一定的不足和局限性，FABP5 调控Vimentin 的具体分子机制尚不清楚，是否通过泛素化机制仍有待进一步证实。后续将进一步完善FABP5 与Vimentin调控肝癌细胞迁移的理论基础，为靶向FABP5 治疗肝癌提供更为充分的科学依据。

【Author contributions】TANG Yanping performed the experiments and wrote the article.LI Kezhi，CAI Zhengmin and TAO Hao performed the experiments.TANG Jiaying，LI Xueyu and LI Yanjuan revised the article.CAO Ji designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.