肿瘤内皮标记物1通过丝裂原活化蛋白激酶途径介导内皮细胞对血管新生及对心力衰竭心肌重塑

徐婷 黄薇 杨力 余浩

武汉市第一医院（武汉市中西医结合医院）心血管内科（武汉 430022）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠心病最重要和最严重的表现之一，并最终导致心力衰竭（heart failure，HF）［1］。HF 的基本病理生理机制是心室重构，特别是过度的心脏纤维化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积聚［2］。MI 引起的心脏纤维化主要是由于心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的激活，然后分泌大量的ECM［3］。CFs 的起源细胞已被广泛研究，除了心脏常驻成纤维细胞外，也可以来源于内皮细胞［4］。内皮细胞经历表型转化并获得间充质表型，这一过程称为内皮-间充质转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）［4］。在此过程中，内皮细胞失去其内皮特性，并通过表达α-SMA 和波形蛋白获得迁移和侵袭性间充质表型，最终促进CFs 的过程［5］。然而，EndMT 如何参与MI 后心肌纤维化的详细分子机制仍不完全清楚。肿瘤内皮标记物1（tumor endothelial marker 1，TEM1）是一种跨膜糖蛋白，在胚胎发生期间出现在间充质谱系来源的细胞上，但其表达在出生后大大降低［6］。在肿瘤血管生成、器官纤维化和伤口愈合中发现TEM1 的再上调，表明其在组织重塑和修复中的潜在作用。有研究［7］发现，TEM1 在心脏损伤后上调并参与心脏重塑。然而，TEM1 的表达是否通过调节内皮细胞的细胞行为参与心脏纤维化尚不清楚。本研究的主要目的是探讨小鼠MI 后心脏组织TEM1 表达的变化以及TEM1 对心脏重构过程中心肌细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型和体内实验 本研究使用的野生型C57BL6 小鼠（6 ～ 8 周龄）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。参照文献［8］方法，通过冠状动脉左前降支的永久性结扎在雄性小鼠中产生MI 模型。动物实验经本院伦理委员会批准（编号：EI-20-1041）。体内实验分为两个阶段。

在第一阶段，在第1、3、7 和28 天收集MI 小鼠心脏的梗死边缘、梗死和远端组织（每个时间点n= 4）。通过实时PCR（RT-PCR）评估在不同时间点MI 小鼠的每个测定的心脏区域中TEM1 表达水平。建立了一个假手术组，其中小鼠进行了类似的外科手术，但没有结扎冠状动脉的左前降支。此外，在第1、3、7 和28 天（每个时间点n= 4），通过CD45+CD31+磁珠分选MI 小鼠梗死边缘区的血管内皮细胞［9］，并通过Western blot 检测TEM1 的表达水平。

在第二阶段，将小鼠随机分成4 组，包括假手术组、MI 组、MI+sh-NC 组和MI+sh-TEM1 组，每组16 只。除假手术组，其他组建立MI 模型。MI+sh-NC 组和MI+sh-TEM1 组分别在建模后进行TEM1 shRNA 慢病毒注射。然后，在第28 天评估小鼠的心脏功能（每组n= 6）。每组4 只小鼠用于在第7 天通过免疫荧光染色检测梗死边缘区EndMT 的变化。此外，在第7 天收集3 组中梗死边缘区的心肌，并分选内皮细胞以通过Western blot 试验检测EndMT 和信号传导途径的变化（每组n= 6）。

1.2 细胞分离和培养 参照文献方法［10］，从C57BL6 小鼠（8 ～ 12 周龄）的腹主动脉获得小鼠主动脉内皮细胞（mouse aortic endothelial cells，MAECs）。将MAECs 在ECM（美国science cell 公司）中培养，培养温度为37 ℃，取第2 ～ 4 代细胞用于实验。为了评估TEM1 对MAECs 的作用，将细胞实验分为3 组：对照组、Vector 组和rTEM1 组。对照组未经任何处理，Vector 组加入溶媒DMSO，rTEM1 组用浓度为250 nmol/L 重组TEM1（Recombinant TEM-1，rTEM-1，上海碧云天公司）处理细胞48 h，然后通过Western blot 评估内皮细胞中EndMT 和MAPKs 信号通路的变化。此外，在经DMSO 或MAPK 抑制剂SB203580（1 μmol/L；美国Selleck 公司）预处理的MAECs 中，用rTEM1（250 nmol/L） 处理细胞48 h，然后用Western blot检测EndMT、MAPKs 信号通路的水平。

1.3 标本采集和组织制备 根据实验需要，在不同时间点从MI 小鼠收集心脏组织。收集MI 小鼠的梗死边缘、梗死区和远端区，提取mRNA，通过RT-PCR 检测TEM1 表达。将心室组织依次浸入3 mL 肝素钠（0.15 mg/mL）、冷心脏停搏缓冲液（3% KCl）、PBS 和4% PFA 溶液中，之后将样品包埋在OCT 化合物中，并从心室组织的心尖到基部切成横切面。将每个心脏切成5 等份，其中3 个切片用于免疫荧光染色。

使用CD45+CD31+微珠（德国MiltenyiBiotec 公司）从MI 小鼠心脏的心肌组织中分离内皮细胞。然后，提取细胞的蛋白质以检测EndMT 和MAPKs信号通路的水平。

1.4 细胞活力测定 CCK-8 分析用于计算内皮细胞的存活力。将MAECs（1 000/孔）接种在96 孔板中，培养过夜，然后用 rTEM1（250 nmol/L）处理不同的时间间隔（12、24、48 h）。随后，向细胞中加入10 μL CCK-8 溶液（日本DOJINDO 公司）。再孵育4 h 后，使用酶标仪（美国BioTek 公司）检测每个孔在450 nm 的光密度（OD）值。

1.5 实时 PCR 分析 使用TRIzol 试剂（日本Takara 公司）从心脏组织和细胞中提取总RNA，和使用PrimeScript RT Master Mix 试剂盒（日本Takara公司）将1 μg 总 RNA 逆转录成cDNA。然后使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本Takara 公司）进行qRT-PCR，并将数据标准化为GAPDH 表达。使用ABI 7500 仪器（美国 Applied Biosystems 公司）在标准qRT-PCR 条件下（95 ℃ 30 s，随后95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s 的40 个循环）测定样品的表达。靶基因的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如下：TEM1：F：5′-CATTATGCAGCTGCTTTGGA-3′，R：5′-GTCGTAGTCCCCTGTGGAGA-3′；GAPDH：F：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，R：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.6 蛋白质印迹分析 使用放射免疫沉淀测定缓冲液（北京Solarbio 公司）提取细胞和组织中的蛋白质。通过BCA 测定法定量蛋白质样品的浓度。等量的蛋白质（40 ～ 60 μg）在8% ～ 12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上运行，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后使用以下针对指定靶蛋白的一抗进行探测：抗TEM1 抗体（1∶1 000，美国Thermo Fisher 公司），抗VE-cadherin 抗体、α-SMA 抗体、Vimentin 抗体（1∶1 000，美国Cell Signaling Technology 公司），抗p38、p-p38、p-JNK、JNK抗体（1∶1 000，美国Abcam 公司）和抗GAPDH 抗体（1∶5 000，武汉Proteintech 公司）。将细胞与过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗兔IgG 抗体一起孵育。最后，用ECL plus 试剂（美国Cell Signaling Technology 公司）观察条带。

1.7 跨孔迁移分析 用涂有基质胶的8 μm Transwell 室（美国Corning Costar 公司）评估细胞侵袭。在无血清培养基中以1 × 104细胞/mL 的密度将MAECs 接种到孔中，将600 μL 补充有10% FBS 的DMEM 加入到下室中。迁移48 h后，擦去膜上表面的细胞，在下表面的细胞用4%多聚甲醛固定并用0.01%结晶紫染色。最后，在显微镜下，在5 个随机区域对侵袭细胞进行计数。

1.8 划痕试验 为了评估TEM1 刺激后MAECs 的迁移，进行了划痕试验。将MAECs 以每孔5.0 ×105个/mL 的密度接种在6 孔板中。当细胞达到90%汇合时，使用无菌200 μL 移液管尖端划一道划痕。在板的底部做不同的标记，以保证同一视野中的细胞被连续分析迁移。通过Image-Pro Plus 6.0 确定细胞迁移的距离。

1.9 超声波心动描记术 使用带有Ms-400 线性换能器的Vevo 2100 系统（加拿大Visual Sonics 公司）产生经胸超声心动图，以测量小鼠在MI 后第28 天的心脏功能。获得来自5 个连续心动周期的数据，用于计算LVEF（%）、LVFS（%）值。

1.10 免疫荧光染色 将来自MI 小鼠的心脏切片（5 μm）与 CD31（英国Abcam 公司，1∶250）或波形蛋白（英国Abcam 公司，1∶200）在4 ℃下孵育过夜，之后载玻片与二抗在室温下孵育1 h，细胞核用DAPI 染色。使用蔡司荧光显微镜对载玻片进行成像。每只小鼠取3 个不同心脏切片用于CD31 和波形蛋白的共染色计算。

1.11 统计学方法 使用SPSS 19.0 进行统计分析，计量数据表示为均数±标准差。两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单向方差分析和事后Tukey 检验或双向方差分析和事后Bonferroni 检验。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MI 小鼠梗死边缘区内皮细胞TEM1 表达增强 在梗死边缘区的心肌中，TEM1 mRNA 水平在MI 后第1 天轻微增加，在第7 天显著达到峰值，然后在第28 天降低。然而，在MI 后28 d，TEM1 的表达在梗死和远端区域没有显示出明显的变化（图1A-C）。在第1、3、7 和28 天从小鼠中分离MI后梗死边缘区的内皮细胞，然后提取总蛋白。WESTERN BLOT 测定结果显示，内皮细胞中的TEM1 蛋白水平在第1 天上调，在第7 天显著增加，然后回到基线（图1D-E）。

图1 MI 后梗死边缘心肌的内皮细胞中 TEM1 表达增强Fig.1 The expression of TEM1 in endothelial cells of myocardial infarction margin increased after MI

2.2 TEM1 促进内皮细胞增殖和 EndMT 与Vector组相比，rTEM1组MAECs在 48 h的OD值显著增加（P＜ 0.001），见图2A。Western blot分析EndMT的结果显示，与Vector 组相比，rTEM1 组MAECs 中VE-Cadherin 蛋白表达显著下降（P＜ 0.05），和α-SMA和波形蛋白水平显著增加（P＜ 0.05），见图2B。

图2 TEM1 促进内皮细胞间充质转化和胶原合成Fig.2 TEM1 promoted mesenchymal transition and collagen synthesis of endothelial cells

2.3 TEM1 诱导内皮细胞迁移、侵袭和血管生成 与Vector 组相比，rTEM1 组MAECs 的相对迁移距离、侵袭细胞数和形成分支数量显著增加（P＜ 0.001），见图3。

图3 TEM1 在体外诱导内皮细胞迁移、侵袭和血管生成Fig.3 TEM1 induced migration，invasion and angiogenesis of endothelial cells in vitro

2.4 MAPKs通路部分参与介导TEM1诱导的内皮细胞EndMT 与Vector 组相比，rTEM1 组MAECs中p-P38/P38 和p-JNK/JNK 蛋白表达增加（图4A）。为了进一步研究MAPKs 信号通路的激活是否与TEM1 对内皮细胞EndMT 的调节作用有关，进行了挽救实验来测试TEM1 诱导的内皮细胞EndMT与MAPK 抑制剂SB203580 之间的关系。结果表明，SB203580 逆转了由rTEM1 诱导的VE-Cadherin蛋白表达下降，和降低α-SMA 和波形蛋白水平（图4B）。此外，与rTEM1+DMSO 组相比，rTEM1+SB203580 组MAECs 的相对迁移距离、侵袭细胞数和形成分支数量显著降低（P＜ 0.01），见图4C-E。

图4 TEM1 激活内皮细胞中的MAPKs 信号通路Fig.4 TEM1 activated MAPKs signaling pathway in endothelial cells

2.5 TEM1 敲除部分消除了EndMT 和心脏纤维化，并增强了MI 后的心脏功能 与MI+sh-NC 组相比，在第7 天MI+sh-TEM1 组小鼠中TEM1 mRNA和蛋白质表达水平均显著降低（图5A、B）。与Sham组相比，在MI 后第7 天，在其他3 组中波形蛋白和CD31 共染色的水平都显著增强。相反，与MI 组相比，MI+sh-TEM1 组中的CD31+Vimentin+共染色水平显著降低（P＜ 0.01），见图5C。在第28 天，通过超声心动图测量心脏功能，MI+sh-TEM1 组小鼠的LVEF 和LVFS 均较MI 组显著增强（P＜ 0.05），见图5D。与MI 组相比，MI+sh-TEM1 组小鼠的内皮细胞中p-P38/P38 和p-JNK/JNK 蛋白表达降低（图5E）。

图5 在MI 小鼠中通过慢病毒敲除TEM1 基因减少了心脏纤维化并改善了心脏功能Fig.5 Knockout of TEM1 gene by lentivirus in MI mice reduced cardiac fibrosis and improved cardiac function

3 讨论

本研究发现小鼠MI 后，在梗死边缘区域的TEM1 表达发生改变，在远端区域和梗死区域没有观察到显著变化。此外，TEM1 上调诱导内皮细胞EndMT 和胶原合成，敲低TEM1 可通过减轻EndMT改善MI 小鼠的心功能。这些结果表明，心脏损伤后TEM1 在心脏中的表达增加，并作为参与心脏重塑的功能蛋白发挥作用。

TEM1 在胚胎发育、癌症的基质和新生血管期间广泛表达，但在成人正常组织中沉默［11］。在这种情况下，TEM1 已被证明定位于几种细胞类型，包括肿瘤基质的血管周细胞、内皮前体细胞、成纤维细胞以及恶性细胞［12-13］。有研究［14］证实TEM1是一种对损伤有反应的功能蛋白，并参与包括心脏在内的器官损伤的病理生理学过程。MI 后，受损心脏组织含有多种细胞，包括浸润性免疫细胞，尤其是巨噬细胞、心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞［15］。本研究中从MI 后28 d 内的小鼠梗死边缘区提取内皮细胞，并进行Western blot 和RT-PCR分析以测量TEM1 表达。结果表明TEM1 表达在第7 天显著增强。

内皮细胞通过释放多种细胞因子在维持心血管系统的体内平衡方面发挥着关键作用［16-17］。内皮依赖性功能障碍已被证明存在于多种类型的心血管疾病中，其能分泌许多细胞因子，如NO、ET-1和TGF-β1，进而促进多种病理生理过程，包括炎症反应、组织重塑、内质网应激和其他过程［18］。因此，内皮细胞作为旁分泌细胞，在心血管疾病中起着关键作用。在这项研究中，内皮细胞在MI 后高度表达TEM1。此外，通过rTEM1 体外诱导内皮细胞上调TEM1，可促进细胞迁移、侵袭和血管生成。同时，体内数据显示，TEM1 敲低减少了MI 后血管内皮细胞标记物如CD31 和VE-钙粘蛋白在小鼠心脏中的表达。有研究［19］证实，TEM1 缺陷小鼠的胶原蛋白含量比野生型小鼠低。在肾纤维化中，TEM1 基因敲除小鼠的肾纤维化程度较低。笔者认为，MI 后体内的自发代偿机制导致血管内皮细胞活化和增殖，进而导致梗死心脏血管密度增加。因此，TEM1 可以通过直接激活心脏成纤维细胞诱导CFs，这为未来的研究提供了方向。

本研究结果表明，TEM1 激活MAPKs 通路，并增强MAECs 中P38 和JNK 蛋白的磷酸化水平。EndMT中涉及的信号通路已得到广泛研究，研究［18］表明EndMT 中涉及的信号通路与调节EndMT 的信号通路高度相似。与EndMT 相关的主要信号通路包括MAPKs、PI3K/AKT 和Wnt 信号通路［20］。此外，研究［21］表明，在不同的疾病模型中，MAPKs 通路的磷酸化可以诱导这些信号通路的激活。因此，结合本研究结果，可以推测，通过TEM1 刺激激活MAPKs 通路是促进内皮细胞EndMT 的主要分子机制。为了进一步证明TEM1诱导的EndMT与MAPKs 通路激活相关，用MAPK 抑制剂SB203580处理内皮细胞，然后用rTEM1 刺激内皮细胞，结果显示SB203580 逆转了由rTEM1 诱导的EndMT 和血管生成。此外，使用携带TEM1 的慢病毒敲除心梗小鼠中TEM1，导致P38 和JNK 蛋白的磷酸化水平均部分下调。这些结果表明，TEM1 激活MAPKs通路参与了MI 后EndMT 的发病机制。

总之，本研究结果表明，TEM1 诱导的EndMT和血管生成参与了MI 诱导心肌重塑的发病机制，其作用机制与MAPKs 信号通路激活有关。因此，靶向TEM1 可能是一种降低心肌纤维化和改善MI后心脏功能的新的治疗选择。然而，TEM1 是否通过激活其他通路促进内皮细胞EndMT 有待于未来进一步研究。

【Author contributions】XU Ting performed the experiments and wrote the article.HUANG Wei performed the experiments.YANG Li revised the article.YU Hao designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.