Nicastrin、N1ICD及hes1蛋白在小鼠肝脏及肝癌组织中的表达

严璐 史天威，2

1河南中医药大学第五临床医学院、河南中医药大学人民医院、郑州人民医院（郑州 450000）；2郑州大学人民医院、河南省人民医院、河南大学人民医院（郑州 450003）

Nicastrin 是NCSTN 基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白，其在家族性化脓性汗腺炎中研究较多［1-2］。Nicastrin 作为γ 分泌酶复合物中重要以及最大的亚基，可识别底物［3］，阻止大底物与γ 分泌酶活性位点结合［4］。γ 分泌酶复合物是一种膜内天冬氨酸蛋白酶，催化单跨1 型跨膜蛋白在膜内蛋白水解调控的最后一步，研究最多的底物是β-淀粉样肽前体蛋白（APP）与notch 受体［5］。

Notch 信号通路是一条进化保守的通路，决定细胞命运，参与胚胎、组织发育，器官形成以及组织修复等生物学过程［6］，该信号通路突变与多种遗传性疾病及肿瘤性疾病相关［7］，其在肝脏中作用复杂，参与各种肝脏疾病的生理病理过程，在肝细胞癌（HCC）中发挥促癌［8］或抑癌作用［9］，而对于notch1 受体而言，国内研究大多认为notch1 在肝癌组织中表达增多［10-11］，国外研究［12］发现notch1 在肝癌组织中有表达降低的现象，为了明确这种矛盾现象，我们通过检测小鼠肝癌组织中相关蛋白的表达情况试图找到答案。

以notch1 通路为基点，其与NCSTN 基因调控相关［13］，且近年来研究者发现NCSTN 基因在HCC中作为促癌基因［14］，在HCC 患者中，癌组织中的NCSTN mRNA 相对与正常肝脏组织表达增高［15］，而目前有关nicastrin 在小鼠肝脏组织如何表达研究较少。另有Notch 通路下游靶基因hes1 也参与肝脏肿瘤的进展［16］，同样目前有关hes1 在动物肝脏组织中如何表达以及如何参与肝细胞癌的研究较少。综上，本研究欲通过检测nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠肝癌组织及正常肝脏组织中的表达进一步明确这3 种蛋白在小鼠HCC中的作用，再通过免疫组化实验观察nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠肝脏组织中的定位表达，为后续的相关研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞株 本课题使用的野生型（WT）C57BL/6 小鼠为我们前期课题所获取，Hepa 1-6 细胞株购自富衡生物。所有的动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行，并得到了河南中医药大学第五临床医学院科研伦理委员会的批准（编号：KY2021-004-011-D）。

1.2 主要试剂 1640 培养基、PMSF 以及BCA 定量试剂盒购自中国Solarbio 公司，胎牛血清购自中国Bio-Ind 公司，胰酶购自中国Servicebio 公司，RIPA 裂解液及SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自中国晶彩公司，粉剂型抗原修复液、HRP 试剂和DAB 染色液购自中国迈新生物公司，一抗稀释液购自中国赛诺特公司，anti-NCSTN、Cleaved-Notch1、Hes1、GAPDH 以及二抗购自中国Proteintech 公司。

1.3 主要仪器 生物安全柜（美国Thermo 公司），超净工作台（苏州安泰技术公司），CO2培养箱（上海力申科学仪器公司），离心机（美国Thermo公司），数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器公司），显微镜（德国徕卡仪器公司），电泳仪（美国Bio-Rad 公司），蛋白凝胶成像仪（美国Azure Biosystems 公司），Tissue-Tek Prisma Plus染色机（樱花医疗科技公司）。

1.4 实验方法 从12 只日龄为6 周的正常野生C57BL/6 小鼠中随机挑选6 只小鼠用于构建小鼠肝癌模型（模型组），剩余6 只实验小鼠作为对照组，注射肝癌细胞及生理盐水前对所有实验小鼠进行称重记录。

1.4.1 构建小鼠肝癌模型 Hepa 1-6 肝癌细胞在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS 缓冲液调整细胞悬液浓度至5×107/mL 用于实验，每只小鼠注射20 μL。

腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，浓度0.2% ～0.3%，注射剂量0.4 mL/20 g。麻醉后仰卧位并固定四肢于实验板上，参考文献［17］对实验小鼠注射肝癌细胞，对照组小鼠注射同等量的生理盐水，造模周期为14 d。

1.4.2 组织样本的获取 造模结束后分别留取对照组正常肝脏组织及模型组肝脏癌变组织，一部分置于7 ～ 10 倍留取组织体积的10%中性缓冲福尔马林固定液中进行IHC 实验，剩余部分保存于-80 ℃冰箱中用于Western blot 实验。

1.4.3 肝组织HE 染色 HE 染色在Tissue-Tekr Prisma 仪器上进行操作的。石蜡包埋、切片处理后，烤片2 h，放置仪器中进行HE 染色，结束后经中性树胶封片。

1.4.4 肝组织免疫组化实验（IHC） 石蜡切片经脱蜡、水化后，用柠檬酸抗原修复法进行抗原恢复，切片上滴加3% H2O2室温孵育10 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，滴加anti-nicastrin，anti-notch1（Val1744）及anti-hes1，比例同说明书，室温下孵育1 h，PBS 冲洗后，HRP 试剂室温孵育30 min，PBS 冲洗同上，滴加新鲜配置的DAB 显色剂显色，流水冲洗停止染色，苏木精复染，分化液分化，PBS 返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶密封，显微镜下观察。

1.4.5 Western blot 实验 使用RIPA+PMSF 法提取组织总蛋白，每管按1∶100 比例依次向2 mL 研磨适配管中加入RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂和PMSF 共1 mL 进行肝脏蛋白的提取，按照BCA 蛋白试剂盒说明书定量。制备SDS-PAGE 凝胶电泳分离（80 V，30 min；120 V，1.5 h），转膜（100 mA，2 h），5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗4 ℃过夜（抗体同1.4.4 实验），二抗室温孵育2 h，1×TBST 漂洗后滴加发光液后进行成像，用ImageJ 分析灰度值，用目的灰度值/GAPDH 灰度值的比值进行统计分析。

1.4.6 生物信息学分析 应用UALCAN数据库分析NCSTN、notch1 和hes1 在肝癌和正常组织中转录和蛋白水平的表达。

1.5 统计学方法 本实验结果均以均数±标准差（SD）表示，统计学分析采用graphpad prism 8.3 软件进行分析，结果使用t-test表示，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原位肝癌模型小鼠肝脏肉眼观和HE 染色镜下观 注射肝癌细胞2 周后，肝脏变化如图1a、b、c所示，肉眼观小鼠肝脏均长出肝癌组织团块，相比正常肝脏组织，触之质硬。HE 染色如图1 a1、b1、c1 黄色箭头所示，低倍镜下可见肝小叶结构消失，中央静脉及汇管区消失，代之以大小不等排列不规则的癌细胞，图1 a2、b2、c2 为相对应的高倍镜视野，可见正常肝细胞及肝窦内皮细胞消失，代之核浆比例增大的肝癌细胞。

图1 肝癌肉眼观图及HE 染色结果Fig.1 Hepatocellular carcinoma macroscopic view and HE staining

2.2 Nicastrin、N1ICD 及hes1 蛋白在小鼠正常肝脏组织及肝癌组织中的表达 IHC 结果显示，nicastrin、N1ICD、hes1 蛋白的表达在正常肝脏组织中（图2 a1、b1、c1）均定位于肝窦内皮细胞，肝细胞基本不表达；相比正常肝脏组织，nicastrin（a2）蛋白在肝癌组织中表达增加，N1ICD（b2）和hes1（c2）蛋白在肝癌组织中表达降低。WB 结果显示（图3），相比正常肝脏组织，nicastrin 蛋白在肝癌组织中表达增高（P＜ 0.01），N1ICD、hes1 蛋白在肝癌组织中表达下降（N1ICD：P＜ 0.05）（hes1：P＜ 0.01）。

图2 Nicastrin、N1ICD 和hes1 在小鼠肝细胞及肝癌细胞中的表达Fig.2 Expression of nicastrin，N1ICD and hes1 in mouse hepatocellular carcinoma cells and hepatocytes

图3 Nicastrin、N1ICD 和hes1 蛋白在小鼠正常肝脏组织及肝癌组织中的表达Fig.3 Expression of nicastrin，N1ICD and hes1 proteins in normal liver tissue and liver cancer tissue of mice

2.3 NCSTN、notch1 和hes1 在肝癌患者中的表达情况 UCLCAN 数据库检索结果显示，相比正常肝脏组织，NCSTN mRNA 在肝癌组织中表达增高（P＜ 0.05），notch1 mRNA 和hes1 mRNA 在正常肝脏组织和肝癌组织中的表达无差异（P＞ 0.05）；相比正常肝脏组织样本，NCSTN 表达的蛋白在肝癌组织中表达增多，notch1 蛋白在肝癌组织中表达降低（图4）。

图4 肝细胞癌不同样本中NCSTN 和notch1 转录及蛋白表达水平和hes1 转录表达水平Fig.4 NCSTN and notch1 transcription and protein expression levels and hes1 transcription expression levels in different hepatocellular carcinoma samples

3 讨论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的第三大原因［18］，其起病隐匿、缺乏早期诊断和预防方法［19］，晚期肝癌难以治愈且容易复发，严重影响患者的生存质量。HCC 是肝癌中最常见的类型，其占比可达90%，发病率在全球范围内处于不断增长中，仍然是全球性的健康挑战［18］。

NCSTN 基因在HCC 中发挥致癌作用［14-15，20］，但现有研究较少记录nicastrin 蛋白在小鼠肝细胞及肝癌细胞中的定位表达，大多研究应用人肝癌细胞株进行研究，且nicastrin 在不同肝癌细胞株中表达不一致［20］，目前缺少nicastrin 在hepa1-6 细胞构建的小鼠肝癌组织中表达的研究。本研究显示nicastrin 在肝癌组织中表达增多，生信分析支持在肝癌组织中NCSTN 的表达增高，故本实验认为NCSTN 在以hepa1-6 细胞构建的小鼠肝癌中发挥促癌作用。

Notch1 是notch 家族成员之一，参与多种癌症的发病［21］，其在肝癌组织中常常高表达［11，22］，发挥促癌作用［23-24］，也有研究［12，25］观察到notch1与NICD1在HCC 组织中表达下降。就现有的研究而言，尚未确定notch1 在HCC 中的具体作用，本实验结果与notch1 在小鼠肝癌组织中表达降低的结果一致，认为notch1 作为抑癌分子参与小鼠肝细胞癌的生长，且目前尚无notch1 在使用hepa1-6 细胞构建小鼠肝癌模型中如何表达的研究，生信分析显示存在notch1 低表达肝癌患者，因此应用hepa1-6细胞构建的小鼠肝癌模型可作为notch1 低表达患者的肝癌动物模型用于实验研究。

Hes1 是螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白家族的一份子，其作为抑制因子或激活因子在细胞分化、存活和凋亡中发挥作用［26］。在HCC 中，hes1 可通过调节CDKN1C/P57 的表达诱导人HCC 的衰老［16］，KK-LC-1 还可通过激活notch1-hes1 信号通路促进HCC 的进展［27］，研究［28］还发现hes1 在人肝癌组织中呈现高表达状态，但在本实验中，我们观察到hes1 在小鼠肝癌组织中表达下降，hes1 受notch 信号通路的调控，在大多研究中我们发现hes1 与notch1 常呈现表达一致性［29-30］，生信分析显示存在hes1 在HCC 中低表达的患者，基于此，我们认为在以hepa1-6 细胞构建小鼠肝癌组织中hes1 发挥抑癌作用。

综上所述，本课题认为nicastrin、N1ICD 和hes1 蛋白主要在小鼠肝窦内皮细胞中表达，肝细胞中表达较少；相比正常肝组织，nicastrin 蛋白在小鼠肝癌组织中表达增多，N1ICD 及hes1 蛋白表达减少；且以hepa1-6 细胞构建的小鼠肝癌模型可作为notch1-hes1 低表达肝癌患者的动物模型用于基础研究。因本实验小鼠数量较少，下一步需扩大数量进一步证实实验结果，并结合相关临床病例进行深入研究。

【Author contributions】YAN Lu performed the experiments and wrote the article.YAN Lu performed the experiments.YAN Lu revised the article.SHI Tianwei designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.