当归芍药散含药血清及其有效成分对肾间质纤维化大鼠的作用及机制

刘化君，张挺

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

慢性肾脏疾病（CKD）在全球的患病率为10%～15%［1-2］，长期的肾脏炎症损伤多会导致肾间质纤维化（RIF）的发生。RIF 是肾小管上皮细胞（RTECs）和肾小管周围毛细血管之间细胞外基质（ECM）的过度沉积，导致间质结缔组织与胶原纤维增多并伴随实质细胞减少的一种病理现象［3］，被认为是终末期肾病阶段的共同途径，是CKD 的主要病理过程之一。当归芍药散（DSS）用于糖尿病肾病、肾病综合征等取得较好疗效［4］，其活血利水作用可有效抑制肾脏慢性炎症损伤，缓解RIF，改善肾功能［5］。NLRP3 炎症小体在诱导肾脏炎症和纤维化中起重要作用，靶向抑制NLRP3 介导的细胞焦亡相关蛋白已成为治疗CKD 的潜在方向［6］。上皮-间质转化（EMT）过程作为RIF的重要影响因素［7］，影响RTECs黏附蛋白的表型改变及间质纤连蛋白（FN）的表达，是近年RIF 潜在治疗机制的研究热点。2020 年9 月—2022 年12 月，本研究利用TGF-β 诱导NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞株肾间质纤维化模型，验证主要效应成分阿魏酸（FA）、芍药苷（PF）与当归芍药散含药血清（DSSS）对肾间质纤维化的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Sprague Dawley 大鼠16 只，购买、饲养均于上海中医药大学实验动物中心，动物实验均经上海中医药大学医学伦理研究委员会批准（伦理学批准号PZSHUTCM211115022）。大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E 细胞），购自上海酶研生物科技有限公司（ATCC 来源）。其他试剂及仪器：胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），100 U/L青链霉素、DMEM-F12培养液（Corning公司），胰蛋白酶-EDTA 溶液（Sigma-Aldrich 公司），BCA 蛋白质定量检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），TGF-β1（Peprotech公司），GMTrans脂质体核酸转染试剂（上海吉满生物科技有限公司），PF（美国MedChemexpress生物科技有限公司），FA（德国Merck公司），酶标仪（美国Bio-TEK，型号：ELX-800），电泳仪及配套电泳槽（美国Bio-Rad 公司，PowerPac 系列），化学发光成像分析仪（美国 Protein Simple 公司），CO2细胞培养箱Model370 series（美国Thermo 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 DSS药液制备 DSS方剂组成为当归9 g、白芍18 g、茯苓12 g、白术12 g、泽泻12 g、川芎9 g，均由上海康桥中药饮片有限公司提供。将以上中药清洗后置于去离子水中浸泡0.5 h，使用煎药锅熬煮2 h，得到水煎液1.5 L，后浓缩得到0.756 g/mL浓度的DSS药液；常温3 000 r/min离心后取上清液，过滤除菌后-20 ℃冷藏备用。

1.2.2 动物分组及处理 16 只大鼠随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组4 只。分组标记后适应性饲养，正常饮食，12 h/12 h 昼夜光照时间，待每组大鼠平均体质量达到180 g即可开始灌胃。灌胃前观察动物一般状态、活动程度、排便情况。空白对照组（0.1 mL生理盐水/10 g体质量）、低剂量组（0.05 mL DSS药液/10 g体质量）、中剂量组（0.1 mL DSS 药液/10 g 体质量）、高剂量组（0.2 mL DSS 药液/10 g 体质量）每日同一时间进行灌胃，持续7 d。

1.2.3 含药血清制备 灌胃第7 日，按照原剂量分组标准灌胃40 min后进行大鼠腹腔注射麻醉行腹主动脉取血术。每只大鼠可取3～5 mL 血液，取得血样置于离心管中室温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取血清并置于-4 ℃保存。待所有大鼠血样完成离心，按照剂量分组将同组血清混合，获得低、中、高剂量DSSS。置于56 ℃水浴30 min 后-80 ℃环境下冷藏。

1.2.4 肾小管上皮细胞培养及分组 将NRK-52E细胞置于完全培养基（含10%胎牛血清、100 U/L青链霉素的高糖DMEM 培养基）中，在37 ℃、5%CO2的培养箱内培养，待对数生长期时用于各项实验。将对数生长期细胞以2×105/孔及2×104/孔密度接种于6孔板和96 孔板中，设置对照组（Control）、模型组（TGF-β 处理）、siRNA 转染组（TGF-β+siRNA 处理）、FA 组（TGF-β+FA 处理）、PF 组（TGF-β+PF 处理）及DSSS 低、中、高剂量组（TGF-β+DSSS-L、TGF-β+DSSS-M、TGF-β+DSSS-H 分别处理）。siRNA 转染组以NLRP3 siRNA-脂质体复合物转染6 h 后，给予4 ng/mL诱导纤维化48 h。siRNA 通过NCBI 数据库获得NLRP3 基因序列，选择siRNA 靶位点后分析序列同源性，避免与其他编码序列/EST 同源序列。使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选择合适目标序列，委托吉满生物科技（上海）有限公司化学合成siRNA，正向引物：5'-GAACUCUUGACCAUUGGCAtt-3'，反向引物：3'-UGCCAAUGGUCAAGAGUUCtt-5'。

1.2.5 DSSS、FA、PF、TGF-β1对NRK-52E 细胞干预浓度选择 待96 孔板中的细胞培养24 h 贴壁后，弃旧培基，加入不同浓度DSSS、FA、PF、TGF-β 的DMEM 培养基。DSSS 浓度梯度：0、2%、4%、6%、8%、10%、12%，FA 浓度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，PF 浓度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，TGF-β 浓度梯度：0、1.25、2.5、3.75、5、7.5、10 ng/mL；每个浓度设5 个复孔，培养48 h。在检测时间点取出96 孔板，避光下加入CCK-8 溶液（每孔10 μL），放入培养箱90 min 后，使用酶标仪测定每孔OD 值（波长450 nm），计算每组细胞的存活率及IC50值，确定DSSS、FA、PF、TGF-β对NRK-52E细胞的干预浓度。

1.2.6 DSSS、FA、PF 对各组细胞焦亡相关蛋白及黏附蛋白作用检测 采用以上实验确定的DSSS、FA、PF 浓度对NRK-52E 细胞进行干预，取细胞裂解离心后上清液进行BCA蛋白定量。使用RIPA、SDSloadingbuffer 配平后，经常规电泳、转膜、封闭，将膜置于相应的一抗稀释液中，4 ℃孵育12 h，多次洗涤后置于相应的二抗稀释液中，室温孵育2 h。加入ECL 检测试剂，利用凝胶成像系统进行成像检测，ImageJ V1.8.0 软件进行灰度值统计分析。以GAPDH 为内参，比较各组间细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18 的表达差异；以β-actin 为内参，比较各组间黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin的表达差异。

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism8.0 统计软件。符合正态分布计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时用LSD-t检验，方差不齐时用Tamhanes's T2法并行Tukey 事后检验；重复测量数据采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DSSS、FA、PF、TGF-β 对NRK-52E 细胞的干预浓度 不同成分干预NRK-52E 细胞48 h 后，酶标仪于450 nm 波长处测量OD 值，计算所得IC50值。DSSS 在血清浓度小于5%时对细胞生长有促进作用，占比为5%时其对于NRK-52E 细胞的生存率影响最小，故DSSS 治疗组分别以5%浓度低、中、高剂量DSSS 进行干预，见图1A。诱导纤维化模型细胞所用TGF-β浓度越高，细胞存活率越低，其IC50在7.352 ng/mL，故模型组给予完全培养基稀释至4 ng/mL 的TGF-β 溶液诱导纤维化模型，见图1B。PF 的IC50在350.9 μmol/mL，故筛选200 μmol/mL浓度作为可行的干预浓度，见图1C。FA 的IC50为222.8 μmol/mL，故筛选75 μmol/mL 为可行的干预浓度，见图1D。

图1 不同浓度DSSS、TGF-β、PF、FA对NRK-52E细胞存活率的影响

2.2 各组细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18 表达 使用TGF-β 刺激后，模型组中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18 表达增加，siRNA转染后可抑制NLRP3 表达，并降低CASP-1、GSDMD、IL-18 表达。相较于模型组，DSSS 各剂量组、FA 组、PF 组细胞焦亡相关蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18表达比较（± s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别对照组模型组siRNA转染组FA组PF组DSS低剂量组DSS中剂量组DSS高剂量组IL-18 0.210 ± 0.010 1.117 ± 0.090#0.217 ± 0.017*0.767 ± 0.084*0.294 ± 0.035*0.704 ± 0.079*0.536 ± 0.051*0.321 ± 0.062*NLRP3 0.165 ± 0.012 0.794 ± 0.052#0.171 ± 0.011*0.370 ± 0.043*0.183 ± 0.013*0.424 ± 0.070*0.391 ± 0.005*0.153 ± 0.009*GSDMD 0.232 ± 0.024 0.540 ± 0.047#0.111 ± 0.011*0.412 ± 0.081*0.091 ± 0.017*0.170 ± 0.010*0.389 ± 0.059*0.252 ± 0.038*CASP-1 0.159 ± 0.006 1.020 ± 0.029#0.164 ± 0.020*0.541 ± 0.040*0.211 ± 0.014*0.590 ± 0.094*0.276 ± 0.026*0.301 ± 0.045*

2.3 各组细胞纤维化相关蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表达 使用TGF-β 刺激后，细胞FN 蛋白表达增加，E-Cadherin 表达下降，N-Cadherin 表达上升，E-Cadherin 与N-Cadherin 表达比值下降。DSSS中、高剂量可降低FN 蛋白表达；DSSS 各种剂量可抑制N-Cadherin 表达，并降低E-Cadherin/N-Cadherin比值；FA、PF 均能改善纤维化相关黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表达情况；相较于模型组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞纤维化相关蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin表达比较（± s）

注：与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别对照组模型组siRNA转染组FA组PF组DSS低剂量组DSS中剂量组DSS高剂量组E-Cadherin/N-Cadherin 2.606 ± 0.107 0.733 ± 0.015#1.234 ± 0.026*1.013 ± 0.032*2.322 ± 0.095*1.548 ± 0.035*1.831 ± 0.059*2.444 ± 0.157*FN 0.730 ± 0.079 1.436 ± 0.052#0.464 ± 0.037*1.193 ± 0.070*1.018 ± 0.020*1.388 ± 0.036 0.858 ± 0.037*0.640 ± 0.033*E-Cadherin 1.330 ± 0.046 0.922 ± 0.008#1.178 ± 0.014*1.141 ± 0.119*1.354 ± 0.037*1.016 ± 0.017 0.829 ± 0.029 1.064 ± 0.039 N-Cadherin 0.511 ± 0.031 1.258 ± 0.025#0.955 ± 0.023*1.124 ± 0.081*0.584 ± 0.028*0.656 ± 0.009*0.453 ± 0.001*0.436 ± 0.012*

3 讨论

RTF 是CKD 的主要病理症状之一，其纤维化过程的关键步骤包括：①肾脏损伤引发的炎症激活和免疫细胞浸润；②生长因子、趋化因子和细胞因子等促纤维化介质的释放；③细胞外基质合成/降解的不平衡，肌成纤维细胞的激活和ECM 在肾小管间质的过度积聚；④EMT 和实质细胞的不可逆转的损失；⑤肾脏微血管的减少［8］。RETCs 广泛参与RIF 过程，RETCs 的氧化损伤、炎症募集、黏附蛋白表达、EMT等过程促使RIF进展［9-11］。

细胞焦亡是一种高度促炎性的细胞程序性死亡方式，其促炎性来自于裂解性细胞死亡释放炎症因子IL-18、IL-1β，经典通路中NLRP3 炎症小体介导CASP-1、GSDMD蛋白的活化、成熟［12］，最终由GSDMD在细胞膜上形成寡聚孔道，使细胞肿胀破裂，释放被CASP-1 剪切成熟的促炎物质IL-18、IL-1β 等，放大肾脏炎症，在RIF 炎症过程中起重要作用。故使用药物对NLRP3、CASP-1、GSDMD 进行抑制，可影响细胞焦亡的激活、炎症蛋白的剪切与活化、穿孔素导致的细胞死亡及促炎作用，从而干扰细胞焦亡进程，减轻肾脏炎症及纤维化进程［13］。

本研究用于制作纤维化模型NRK-52E 细胞的TGF-β分子，是纤维化过程的主要效应子［14］。TGF-β结合于RETCs 表面受体，并发起下游信号转导，促使RETCs 改变增强EMT 过程，加速ECM 的产生和堆积；能激活MAPK、TNF、NF-κB等蛋白促进炎症表达［15］，激活细胞焦亡通路。在RIF 过程中EMT 不可忽视，RETCs 表面黏附蛋白的表达变化，如E-Cadherin 蛋白的降低和N-Cadherin 蛋白的增加［16］，被认为是EMT 进展的常见情况。随着EMT 过程和炎症信号的增强，免疫细胞募集浸润、RETCs 稳态丢失、黏附蛋白表型改变、亚稳态间充质细胞增加、细胞外基质蛋白沉积等因素综合后，则在肾间质形成慢性炎症和纤维化环境［17］。

在体外实验中，使用4 ng/mL浓度的TGF-β可增强NRK-52E 细胞焦亡核心分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白与炎性因子IL-18 表达，提示激活了NLRP3 炎症小体的组装和促炎因子的释放；细胞表层E-cadherin 表达减少，FN 和N-cadherin 表达增加，提示ECM中FN的数量增加，间质纤维化进展并伴随EMT过程的发生。在使用NLRP3 siRNA脂质粒复合体转染沉默NLRP3 蛋白合成后，可观察到焦亡通路受抑制对RETCs黏附蛋白表型的保护作用。纤维化标志物FN 的表达降低及E-Cadherin/N-Cadherin 的增大，提示EMT 与RIF 进展被抑制。研究表明，NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡被抑制，RIF 被缓解［18］，均佐证NLRP3 炎症小体介导的经典途径焦亡与RIF、EMT过程有较强的相关性。

综上所述，DSSS及其有效成分中的FA、PF均能明显抑制TGF-β 诱导的NRK-52E 细胞纤维化模型中焦亡相关蛋白及纤维化蛋白表达，缓解RIF 及RETCs的EMT的发生发展。