河南汉族缺血性脑血管病患者半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因多态性检测△

路 燕 刘炯波 董 蕾 滕军放

1)河南新乡市中心医院 新乡 453000 2)河南淇县人民医院 淇县 456750 3)郑州大学一附属神经内科 郑州450052

近年来缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的病因及发病机制研究已取得很大的进展,半胱氨酸蛋白酶抑制因子C(Cystain C)也受到越来越多研究者的关注。作者通过病例对照研究,采用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)方法,探讨Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因与ICVD的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 185例缺血性脑血管病(ICVD组)和111例对照组来自2008-10～2009-04郑州大学第一附属医院神经内科住院患者及门诊体检者,均为河南汉族人。ICVD组符合1995年第四届全国脑血管病学术会议修订的急性缺血性脑血管病的诊断标准,并经头颅CT和(或)MRI检查确诊;对照组为无缺血性脑血管病史,无临床血管事件发生的神经内科其他住院患者及健康体检者。2组均排除脑出血、蛛网膜下腔出血等出血性脑血管疾病,均无帕金森病、痴呆史,甲状腺疾病,肝脏及肾脏疾病等及服用叶酸、维生素B12、美多芭等药物史。ICVD组185例,男122例,女63例,年龄36～86岁。对照组111例,男71例,女40例,年龄32～87岁。各组年龄及性别差异均无统计学意义(χ2=0.120,P＞0.05;t=1.748,P＞0.05)。

1.2 多态性检测 采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。取EDTA抗凝静脉血2 m L采用CBM公司基因提取试剂盒提取基因DNA。参照文献[3]设计引物,上游引物:5'-AGAGCCAGTGACTGAAGAACC-3',下游引物:5'-GATTTACAGCCAAGGAACATG-3',扩增目的片段长度为474 bp。PCR反应体系为30μL:PCR magic m ix 2.0酶15μL,上下游引物各2.0μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O补至30μL。PCR扩增条件:95℃预变性5 min;95℃变性45 s,55℃复性45 s,72℃延伸55 s,循环30次;72℃延伸5 min。取3 uL PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳30 m in,EB染色检验扩增结果。酶切反应体系为30 μL,包括PCR扩增产物10μL,Sma I 2.0μL,10×Buffer Tango 2.0μL,ddH2O 16μL。酶切产物在30℃水浴箱中温浴5 h,经25 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,EB染色,紫外凝胶成像仪下观察带型并照相。

1.3 统计学处理 所有数据以SPSS统计软件16.0进行处理。对2组基因型频率分布进行Hardy-Weinberg平衡检验。两组年龄比较进行t检验,2组性别比较进行行列表检验,2组间基因型及等位基因频率进行χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组Cystatin C Rs2897119(-177C/T)基因型频率和基因频率分布 符合H ardy-W einberg平衡定律(P＞0.05),说明2组样本有群体代表性。

2.2 Cystatin CRs2897119(-177C/T)基因PCR扩增产物

片段长度为474 bp,经Sma I酶切后,共产生3种基因型:纯合型(T/T型)不含酶切位点,只有474 bp;杂合型(C/T型)有474 bp、271 bp和203 bp 3个片段;纯合子突变型(C/C型)有271 bp和203 bp 2个片段。增产物见图1。

2.3 Cystain C Rs2897119(-177C/T)酶切产物 见图2。

2.4 2组中基因型及等位基因频率分布特征 见表1。2组中Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图1 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR扩增产物电泳图

图2 Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)PCR扩增产物分析结果电泳图

3 讨论

缺血性脑血管疾病(ICVD)是严重危害人类健康的常见疾病之一,发病率和病死率均居神经系统各类疾病首位,严重影响着人们的生活质量及水平,国内学者把缺血性脑血管疾病看作是有多种危险因素相互作用的疾病。近年来有关Cystain C与ICVD关系的研究越来越受到人们的重视,相关研究层出不穷。

Cystain C又称半胱氨酸蛋白酶抑制因子C,由有核细胞产生,为一种含120个氨基酸残基多肽链的非糖基碱性蛋白,其基因位于20号染色体短臂上,分子量为13.395 kD,它的氨基酸序列在人类大多数组织中能够稳定的表达,广泛存在于各种体液中,所有有核细胞均能稳定产生,Cystain C在脑脊液和精液中的浓度最高,尿液中最低。在生理条件下,Cystain C的重要功能是抑制内源性的半胱氨酸蛋白酶的活性,参与细胞内外蛋白质水解的调控,保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶的水解,是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的抑制物。有报道Cystain C有抗病毒和原虫感染的功能,可以影响中性粒细胞的迁移,可以参与肿瘤的侵袭和转移,参与炎症过程及一些神经性疾病[1]。大部分研究认为Cystatin C是一个具有极高的敏感性和较高的特异性的理想肾小球滤过率指标,是反应肾功能受损的重要标志物[2-4]。近年研究发现Cystain C基因突变可导致遗传性Cystain C淀粉样血管病,可发生脑动脉血管破裂,而动物模型试验也证实Cystain C在血中蓄积可以导致脑血管淀粉样变,考虑Cystatin C可能与脑梗死发病有关[5]。也有报道动脉粥样斑块中Cystatin C含量较正常血管减少,而组织蛋白酶S及K却过度表达,认为Cystatin C的缺失可能是动脉粥样硬化的发病机制之一[6]。

本研究结果显示,ICVD组中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型频率T/T、C/C、C/T分别为2.2%、81.6%、16.2%,对照组中Cystain C Rs2897119基因型频率T/T、C/C、C/T分别为3.6%、79.3%、17.1%,2组中T、C等位基因频率分别为10.3%、89.7%和12.2%、87.8%,两组中Cystain C Rs2897119(-177C/T)基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义,表明Cystain C Rs2897119(-177C/T)多态性可能与ICVD不具有关联性。本研究结果与国内相关研究结果一致[3],因此Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)基因多态性可能不是ICVD发生的遗传影响因素。

鉴于所入选的样本例数较少,收集标本时间较短,地域局限,地区差异性不同,入选病例标准不同,有待于增加入选样本例数,延长收集病例时间,进行多地区、多中心研究,以进一步明确Cystain C基因Rs2897119(-177C/T)多态性与ICVD的关联。

表1 CystainCRs2897119(-177C/T)基因型频率及等位基因频率分布 [例(%)]

[1] 何焱,陈敬洲,王惠萍,等.半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystain C基因与中国人卒中的关系[J].中国分子心脏学杂志,2007,7(2):81-84.

[2] 杨继红,王雪东,吴华.Cystain C的临床应用[J].中国中西医结合肾病杂志,2006,7(8):430-432.

[3] 杭宏达,王可平,林洪丽,等.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在临床中国的应用[J].中华现代临床医学杂志,2004,2(3):214-216.

[4] 晏峰,周颖.血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平对急性脑血管病患者早期肾损害的诊断价值[J].现代中西医结合杂志,2007,16(31):4 590-4 591.

[5] 刘存杰,王大力,彭延波.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C与脑梗死的关系[J].中国煤炭工业医学杂志,2008,11(4),496-497.

[6] 胡欣,徐岩.半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、同型半胱氨酸与冠心病的关系[J].心血管康复医学杂志,2008,17(5):461-463.