缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用

胡跃强 唐 农 董少龙 刘尊敬 祝美珍 胡玉英 王棕可

(广西中医学院第一附属医院神经内科，广西 南宁 530023)

脑缺血预处理(BIP)是指对脑组织采用机械刺激，如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受。这种现象又称为脑缺血耐受(IT)。本实验通过建立大鼠局灶性BIP模型，以观察BIP对脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 健康雄性SD大鼠60只，体重(250±50)g，随机将大鼠分为三组:假手术组、大脑中动脉缺血再灌注组(MCAO)、假手术 +脑缺血组;BIP组:预缺血+脑缺血组(BIP+MCAO);每组按照再缺血后12 h、1、2、3 d四个时间点平均分为4个亚组(n=5)。分别作如下处理:假手术组:以假手术代替预缺血及缺血再灌注;MCAO组:以假手术代替预缺血，其余步骤同BIP组;BIP组:MCAO 10 min后抽出栓线，完成预缺血，3 d 后再次行 MCAO 2 h，再灌注后12 h、1、2、3 d 处死大鼠。

1.2 动物模型及标本制备 参照Longa的线栓法进行造模。采用大脑中动脉二次线栓法〔1〕制备大鼠脑缺血预处理模型，结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端，将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入，进线约18～20 mm，MCAO后10 min抽出线栓，完成预缺血。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后规定时间点心腔内抽取动脉血，凝固后立即以3 000 r/min离心15 min，取上血清-80℃保存备测，并同时处死动物取脑。

1.3 观察指标 ①神经细胞凋亡率检测:大鼠迅速断头取脑，分离缺血半暗带脑组织100 mg，1.25 g/L胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，70%乙醇4℃过夜固定样品，次日离心弃乙醇收集细胞，加入50 mg/L RNase，37℃孵育30 min，再加入50 mg/L碘化丙啶，4℃避光染色30 min，300目筛网过滤，利用美国贝克曼-库尔特FC 500流式细胞仪计数10 000个细胞，测定各期细胞DNA含量并计算凋亡细胞所占比例。②血清NSE浓度测定:采用双抗夹心ELISA法检测大鼠血清中的NSE含量。按试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 神经细胞凋亡率检测结果 流式细胞术细胞周期定量分析表明，假手术组未见明显的凋亡峰，其细胞凋亡百分率很低。脑缺血再灌注12 h后，MCAO组细胞凋亡发生率较假手术组显著增加(P＜0.01)，1 d时达到高峰，以后时间点逐渐下降，但仍高于假手术组(P＜0.01);BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。说明BIP具有减轻脑缺血再灌注后神经元凋亡的作用。见表1。

2.2 血清NSE浓度测定结果 假手术组大鼠血清NSE含量很低;大鼠脑缺血再灌注后12 h血清中NSE的含量明显升高(P＜0.01)，至缺血1 d达到高峰，以后时间点逐渐下降，但仍高于假手术组(P＜0.01);BIP组各个时间点血清 NSE较MCAO组显著降低(P＜0.05)。见表2。

表1 各组大鼠神经细胞凋亡率比较(s，%，n=5)

表1 各组大鼠神经细胞凋亡率比较(s，%，n=5)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与MCAO组同时间点比较:2)P＜0.05，3)P ＜0.01

12 h 24 h 2 d 3 d假手术组组别4.5±1.4 5.0±1.8 4.6±1.2 5.2±1.6 MCAO组 34.6±11.51)48.2±12.41)38.7±14.61) 29.2±9.31)BIP组 25.3±9.02) 36.4±10.93)30.8±11.22) 22.5±8.72)

表2 各组大鼠血清NSE比较( s，pg/ml，n=5)

表2 各组大鼠血清NSE比较( s，pg/ml，n=5)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与MCAO组同时间点比较:2)P＜0.05

12 h 24 h 2 d 3 d假手术组组别8.73±2.93 9.68±3.55 10.06±3.19 8.65±3.02 MCAO组19.06±6.541)30.45±9.801)25.90±7.661)18.83±5.751)BIP组 14.50±4.262)23.19±5.382)19.64±4.922)13.66±3.872)

3 讨论

自1990年Kitagawa〔2〕发现缺血耐受以来，对脑缺血防治的认识开辟了新的领域，为脑保护提供了新的思路，这种通过激发机体的内源性保护机制，以增强对下一次严重损伤的抵抗能力的方法受到广泛关注，目前被认为是最强的内源性保护机制。研究表明〔3〕:单次或多次累积时间20～30 min的短暂局灶缺血为最佳耐受诱导剂，可使缺血面积减少达30%，另有实验表明:亚致死性缺血预处理的暴露时间与诱导耐受形成的间歇期，对再次长时间致死性缺血损害的耐受持续时间呈剂量反应曲线关系。缺血预处理耐受机制目前仍不十分清楚，研究表明耐受是涉及递质、受体、通道、基因表达、蛋白质合成的多环节调控的复杂生物学过程。多数人认为它的一般机制为〔3，4〕:缺血预处理可引起组织释放以腺苷为主的内源性递质，并与相应的受体结合，通过激活信号传导通路来启动特定的基因，表达出具有保护作用的效应物，抑制神经细胞的坏死或凋亡，从而发挥对神经元的保护作用。Prasad等〔5〕研究表明，脑缺血预处理可通过激活PI3K-Akt途径发挥抗神经细胞凋亡作用。Du等〔6〕研究发现MLK3信号途径在大鼠脑缺血预处理细胞凋亡保护中发挥重要作用。

本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡，该方法较原位末端标记、DNA凝胶电泳、形态学观察等方法具有定量精细且可避免坏死细胞干扰的优点。本研究提示BIP诱导了脑组织产生某种抗凋亡机制，抑制了再次缺血后神经细胞凋亡。

NSE是糖酵解过程中的一种关键酶，特异地存在于神经系统中，在大脑中含量最高，性质稳定。在缺血性脑损害神经元变性坏死后，NSE可释放出来，透过血脑屏障进入血液中，因而血液中NSE水平可以反映脑损伤的程度。本实验结果与文献报道结果相一致〔7〕。

综上，BIP可以抑制脑缺血损伤后细胞凋亡和坏死，进而起到保护神经元的作用，减轻随后发生的更为严重的致死性缺血性脑损伤。这些有助于进一步了解BIP的作用机制，且对于寻找脑保护的有效途径具有积极意义，其机制值得进一步研究。

1 郝玉曼，罗祖明，周 东.局灶预缺血诱导脑缺血耐受的动物模型〔J〕.中风与神经疾病杂志，2003;20(2):129-30.

2 Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，et al.“Ischemic tolerance”phenomenon found in the brain〔J〕.Brain Res，1990;528(1):21-4.

3 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2006;26(9):1114-21.

4 Steiger HJ，Honggi D.Ischemic preconditioning of the brain，mechanisms and applications〔J〕.Acta Neurochir(Wien)，2007;149(1):1-10.

5 Prasad SS，Russell M，Nowakowska M.Neuroprotection induced in vitro by ischemic preconditioning and postconditioning:modulation of apoptosis and PI3K-Akt pathways〔J〕.J Mol Neurosci，2011;43(3):428-42.

6 Du Y，Li C，Hu WW，et al.Neuroprotection of preconditioning against ischemic brain injury in rat hippocampus through inhibition of the assembly of GluR6-PSD95-mixed lineage kinase 3 signaling module via nuclear and non-nuclear pathways〔J〕.J Neurosci，2009;161(2):370-80.

7 金丽英，刘真友，杨学伟，等.兔脑缺血再灌注后NSE和S-100的表达及其血清水平的变化〔J〕.中国康复医学杂志，2007;22(11):964-7.