人参二醇组皂苷20(s)对大脑中动脉梗死老年小鼠MAPK蛋白表达的影响

张 颖 纪 莉 张馨木 鲍 爽 王 赞 陈海燕 (吉林大学第一医院，吉林 长春 3002)

传统中医认为人参的功能主治为益气活血，通络止痛，可以改善脑血液循环，改善神经行为学，保护缺血脑组织，改善患者半身不遂或偏身麻木、口角偏斜、言语不利等症状，具有很好的临床疗效〔1〕;但其缩小梗死面积、脑保护的具体机制，尤其是脑保护的信号传导机制尚不十分清楚。本研究拟建立老年小鼠大脑中动脉梗死 (MCAO)模型，观察磷酸化胞外信号调节激酶 (p-erk1/2)、磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶 (p-JNK2)、P-38蛋白表达的变化，进一步明确人参二醇组皂苷 (PDS)干预脑缺血后丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的变化。

1 材料与方法

1.1 对象 C57BL/6 18月龄老年小鼠分为4组:组Ⅰ，90 min MCAO组;组Ⅱ，PDS 5 mg/L小剂量组;组Ⅲ，PDS 25 mg/L中剂量组;组Ⅳ，PDS 50 mg/L大剂量组，每组10只。

1.2 方法

1.2.1 老年小鼠MCAO模型制备 采用1%Isoflorin气体麻醉，应用恒温仪使直肠温度保持在37℃，分离结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，将带有硅胶的8.0尼龙线从颈总动脉插入颈内动脉，长度为9 mm，阻断大脑中动脉血流，在90 min时将尼龙线撤出，进行再灌注。

1.2.2 激光多普勒血流仪(LDF)监测 在实验过程中用0.5 mm光纤探头监测脑血流，右侧大脑中动脉区位置为囟门旁开6 mm、后2 mm。大脑中动脉梗死后24 h进行神经功能缺损评分。

1.2.3 Western印迹分析 组织冰冻切片，应用裂解液裂解，取上清液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，等量蛋白被溶于6×SDS缓冲液，煮沸，并载入15%多丙烯胶，蛋白被转移到聚乙烯醇缩甲醛(PDF)膜上，浸在一抗多克隆羊抗p-erk1/2、p-JNK2、P-38中过夜干燥，膜再浸在驴抗羊或羊抗兔二抗中，洗脱后，浸在电化学发光(ECL)显影液中显影。采用IMAGE J软件分析所得蛋白带的灰度值。

1.3 统计学方法 应用SPPS统计软件进行分析，数据资料以s表示，组间差异采用单因素方差分析及配对t检验。

2 结果

2.1 LDF监测结果 老年小鼠术中均进行LDF监测，线栓后LDF的血流值降低到15% ～20%，90 min进行大脑中动脉梗塞模型再灌注，血流恢复50%以上为梗塞再灌注模型成功，两组组间LDF值无明显差异(P＞0.05)。

2.2 各组神经功能评分比较 各组神经功能评分:组Ⅰ(2.3±0.5)分;组Ⅱ(2.1±0.9)分;组Ⅲ(1.7±0.7)分;组Ⅳ(1.5±0.6)分。其中，中、大剂量PDS组(组Ⅲ、Ⅳ)神经功能评分与梗死组(组Ⅰ)比较明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05);小剂量PDS组(组Ⅱ)神经功能评分与梗死组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 Western印迹分析结果 PDS中、大剂量组MCAO老年小鼠脑p-erk1/2、p-JNK2蛋白表达升高(P＜0.05)，P-38蛋白表达无变化(P＞0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测各组老年小鼠β-actin、p-erk1/2、p-JNK2、P-38蛋白表达的变化

3 讨论

缺血性脑梗死不仅可以导致部分脑的血液供应缺乏，而且导致缺血区的神经凋亡和坏死〔2〕。MAPK信号通路能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞多种生物学反应，在细胞的生长、分化及凋亡过程中起着重要作用，并参与脑缺血损伤及神经保护的过程。目前已发现多条并行的MAPK信号通路，erk1/2、JNK2、P-38均与细胞的生长及分化密切相关，其中erk1/2通路被认为是经典的信号通路，在细胞的生长增殖和分化及凋亡过程中起重要作用。有研究表明，通过活化erk1/2，预处理或后处理活化下游抗凋亡分子，可减少脑损伤〔3〕。erk1/2 作为治疗的新靶点日益受到关注〔4〕。Nagata等〔5〕发现JNK和P-38在凋亡中起重要作用。目前已经分离鉴定了近40种人参皂苷，根据其苷元结构可分为齐墩果酸型、原人参二醇型和原人参三醇型，其中原人参二醇型皂苷共有20余种，西洋参叶20(s-)原PDS由五加科人参属植物西洋参叶总皂苷分离纯化得到，主要含有人参皂苷 Rb3、Rd、Rb2和Rbl。本研究显示，PDS 20(s)中、大剂量组老年小鼠脑p-ERK 1/2、p-JNK2蛋白表达升高，P-38蛋白表达无变化，说明 PDS干预MCAO老年小鼠脑早期改变可能与ERK、JNK2通路有关，而与P-38通路无关。MAPK家族成员具有不同的上游激活子和不同的底物，因而可能有不同的机制参与，ERK、JNK2激活后是否通过线粒体途径参与凋亡的过程，尚有待于进一步研究。

1 Park Sl，Jang DK，Han YM，et al.Effect of combination therapy with sodium ozagrel and panax ginseng on transient cerebral ischemia model in rats〔J〕.J Biomed Biotechnol，2011;178:169-80.

2 Kilic U，Kilic E，Reiter RJ，et al.Signal transduction pathways involved in melatonin-induced neuroprotection after focal cerebral ischemia in mice〔J〕.J Pineal Res，2005;38(1):67-71.

3 Zhang L，Zhang ZG，Liu XS，et al.The PI3K/Akt pathway mediates the neuroprotective effect of atorvastatin in extending thrombolytic therapy after embolic stroke in the rat〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007;27:2470-5.

4 Breslin JW，Pappas PJ，Cerveira JJ，et al.VEGF increases endothelial permeability by separate signaling pathways involving ERK-1/2 and nitric oxide〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;284(10):92-100.

5 Nagata Y，Takahashi N，Davis RJ，et al.Activation of p38 MAP kinase and JNK but not ERK is required for erythropoietin-induced erythroid differentiation〔J〕.Blood，1998;92(6):1859-69.