三种方法检测Aβ所致PAJU细胞凋亡

丁斌蓉 涂秋云 杨 霞 白 松 刘 肖 唐湘祁 (中南大学湘雅三医院老年科，湖南 长沙 4003)

研究表明Aβ神经毒性涉及介导氧化应激及炎症反应、神经元内钙超载、诱导细胞凋亡、改变突触功能等多个方面〔1～5〕。其中，诱导细胞凋亡是Aβ神经毒性的一个重要环节。脑卒中和脑缺血后阿尔茨海默病(AD)的发生率显著增加，缺氧是AD的病因之一〔6〕。故观察缺氧条件下Aβ作用所致神经细胞凋亡的情况对探讨AD的损伤机制和评估各种防治因素的效果具有重要意义，选择一种合适的检测细胞凋亡的方法对观察效果起着决定性的作用。为选择一种理想的检测神经细胞凋亡的方法，我们对MTT法、Hoechst 33258细胞核染色法、流式细胞检测这几种常用的观察细胞凋亡的方法进行了观察。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人神经母细胞瘤细胞株(PAJU细胞由芬兰赫尔辛基大学生命科学院 Carl G.Gahmberg教授惠赠);Aβ42(rPeptide公司);MTT、Hoechst 33258(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);低温高速冷冻离心机(Eppendorf)，酶标仪 (SUNRISE，TECAN，Switch);流式细胞计数仪(FACScan，BECTON DICKINSON，USA);荧光显微镜 (BX60，OLYMPUS，Japan);Microtek ScanMaker 5600 扫描仪。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”处理〔7，8〕以储存浓度为231 μmol/L 置于37℃的PBS中孵育7 d左右即为“老化”状态。

1.2.2 细胞培养 PAJU细胞以5×105/孔接种于6孔细胞培养板，37℃，培养稳定后，分组:①常态组:常态 PAJU细胞50 ml/L CO2培养箱培养96 h;②Aβ干预组:将PAJU细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，继续培养96 h;③缺氧组:将PAJU细胞置于缺氧环境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培养箱)培养96 h;④Aβ干预+缺氧组:将PAJU细胞予以浓度为1.0 nmol/L老化的Aβ42干预，并置于缺氧环境中培养96 h。收取细胞样品，分别用MTT法、Hoechst 33258细胞核染色、流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.3 MTT法观察细胞 取对数生长期的上述各组PAJU细胞，于干预前1 d以5×104/孔接种于无菌的96孔板。置37℃、饱和湿度、5%CO2和95%空气的培养箱中继续培养24 h，然后再根据各组细胞的实验要求进一步按上述方法处理和培养至96 h，弃去培养基，加入5 g/L MTT 20 μl后继续培养4 h，最后加入150 μl DMSO，酶标仪测定各孔A490 nm吸光度值。计算细胞存活率。

1.2.4 Hoechst 33258细胞核染色 取对数生长期的PAJU细胞株，调整细胞密度至1×104/ml，接种于无菌24孔板中，每孔1 ml。置37℃、饱和湿度、5%CO2和95%空气的培养箱中继续培养24 h，再根据各组细胞的实验要求进一步按上述方法处理和培养至96 h，并分别于24、48及96 h将四组细胞取出，4%多聚甲醛固定20 min，1 mg/ml的 Hoechst 33258避光染色10 min后封片、避光，荧光显微镜下观察。观察后照相并计数500个细胞核，计算凋亡核百分率。

1.2.5 细胞凋亡率的流式细胞检测 取对数生长期的PAJU细胞株，调整细胞密度至1×106/ml，接种于无菌6孔板中，每孔3 ml。置37℃、饱和湿度、5%CO2和95%空气的培养箱中继续培养24 h，再根据各组细胞的实验要求进一步按上述方法处理和培养至96 h，并分别于24、48及96 h将四组细胞取出，75%乙醇固定细胞，4℃保存。上机前加入PI，孵育10 min。

1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，各组数据均以s表示，用析因分析法进行统计分析，流式细胞学检测中图像分析系统所采集的数据进行χ2检验。

2 结果

2.1 Hoechst 33258细胞核染色 见图1。Hoechst 33258将细胞核染为紫蓝色。正常细胞核呈均匀弥散荧光，凋亡细胞核呈浓染块状或颗粒状荧光。对照组的PAJU细胞24、48和96 h后，细胞中核浓染、边集及碎裂比例较少，经缺氧、Aβ42处理、缺氧+Aβ42共同处理24、48和96 h后，细胞中核浓染、边集及碎裂比例较多。各组凋亡核百分率见表1。

图1 Hoechst 33258细胞核染色PAJU细胞

表1 Hoechst 33258细胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

表1 Hoechst 33258细胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

24 h 48 h 96 h组别

2.2 MTT比色法显示Aβ42、缺氧对细胞增殖的影响 对照组、缺氧组、Aβ干预组、缺氧+Aβ干预组的 PAJU细胞24、48和96 h后存活率见表2。对照组与缺氧组、对照组与Aβ42组，缺氧组或 Aβ42组与缺氧并 Aβ42处理组间差异有显著意义(P＜0.05)。另外，对照组与缺氧并Aβ42处理组间比较具有极显著差异(P＜0.01)。

表2 MTT比色法显示Aβ42、缺氧对PAJU细胞增殖的影响( s，n=3，%)

表2 MTT比色法显示Aβ42、缺氧对PAJU细胞增殖的影响( s，n=3，%)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与缺氧组、Aβ42组比较:3)P ＜0.05，下表同

0.98±0.11 0.94±0.15 0.92±0.23缺氧组 0.82±0.171) 0.67±0.241) 0.63±0.141)Aβ42组 0.78±0.131) 0.57±0.211) 0.37±0.141)Aβ42并缺氧组 0.65±0.112)3) 0.51±0.112)3) 0.31±0.102)3)24 h 48 h 96 h对照组组别

2.3 流式细胞仪检测缺氧、Aβ42所致PAJU细胞凋亡率的影响流式细胞仪检测凋亡细胞(亚G1期细胞)百分率，结果显示PAJU对照组、缺氧处理组、Aβ42处理组、缺氧并Aβ42处理组24、48及96 h后，细胞凋亡率依次分别为(2.11%，3.79%，5.32%;8.23%，17.45%，24.21%;9.89%，19.15%，25.33%;14.12%，23.25%，45.10%)，组间两两比较，对照组与缺氧组、Aβ组比较，其凋亡率有显著增加(P＜0.05);对照组与缺氧并Aβ42处理组比较，其凋亡率有极显著增加(P＜0.01);缺氧组与Aβ组比较，其凋亡率无显著变化(P＞0.05)。

3 讨论

MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其特点是灵敏度高，重复性好，操作简便，无放射性污染，与其他检测细胞活力的方法有良好的相关性〔9〕。本实验在预试验的基础上用MTT比色法检测发现缺氧、Aβ42、Aβ42同时予以缺氧处理能不同程度地影响PAJU细胞的能量代谢，干扰PAJU细胞的增殖和存活，实验细胞存活率下降呈时间依赖性。

Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。本研究发现，缺氧、Aβ42对神经细胞的毒性作用之一是破坏细胞核;此外，还发现，在Aβ42同时予以缺氧处理的PAJU细胞，细胞核损坏更为严重，其凋亡率明显上升，说明缺氧环境可以加重Aβ42的神经毒性作用，这种效应呈时间依赖性。

流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。流式细胞术可以检测的参数有:细胞的体积和形态复杂程度DNA(细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等)，细胞存活能力、细胞凋亡等。本实验流式细胞仪检测结果显示，缺氧、Aβ42对PAJU细胞有抑制作用，缺氧能加重Aβ所致细胞凋亡，与文献一致〔10〕。

通过比较上述MTT比色法、Hoechst 33258细胞核染色、流式细胞技术在本实验中的应用，我们发现这三者对于细胞活性的检测结果基本一致。凋亡的检测方法有多种，不同的样品可以用不同的方法来检测。上述三种检测方法各具特点，可相互补充:MTT比色法快捷、方便，适合悬浮及贴壁生长的细胞的活性检测;Hoechst 33258细胞核染色对于细胞核受损的检测比较敏感，实验所需试剂较多，步骤较MTT法复杂;流式细胞技术更适合用于悬浮生长的细胞，对于贴壁生长的细胞，如果实验前需要刮取细胞，可能破坏细胞完整性，而影响实验结果。

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10 Egashira N，Iwasaki K，Ishibashi M，et al.Hypoxia enhances beta-amyloid-induced apoptosis in rat cultured hippocampal neurons〔J〕.Jpn J Pharmacol，2002;90(4):321-7.