血管紧张素1-7对糖尿病大鼠海马胰岛素降解酶的表达及认知功能的影响

唐燕霞 肖 谦 薛艳艳 张栋珉 (重庆医科大学附属第一医院老年科内分泌组，重庆 40006)

胰岛素降解酶(IDE)作为降解β-淀粉样蛋白(Aβ)的重要酶，是决定生物体体内Aβ含量的关键因素之一，Aβ在脑内的沉积可通过神经毒性作用和诱导神经元凋亡等机制损伤认知功能〔1〕。研究报道，血管紧张素1-7〔Ang-(1-7)〕对学习记忆等认知功能有重要影响〔2〕，但Ang-(1-7)对IDE的表达有无影响，目前还未见报道。本研究以糖尿病大鼠模型作为研究对象，用Ang-(1-7)及其受体拮抗剂A-779进行干预，初步观察Ang(1-7)对糖尿病大鼠海马IDE的表达水平及认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 STZ(Sigma公司);Morris水迷宫及水迷宫记录分析系统(中国医科科学院药物研究所研制);大鼠脑立体定位仪(Stoeling公司);Ang-(1-7)(Sigma公司);Mas受体拮抗剂A-779(Phoenix公司);RT-PCR试剂盒，DNA Marker DL2000(TaKaRa公司);羊抗大鼠IDE多克隆抗体(Santa公司);引物合成:南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及建模 SPF级SD雄性大鼠40只，9～10周龄，体重180～200 g，购自重庆医科大学动物实验中心(SCXK渝2007-0001)。动物适应喂养1 w后，随机原则分为:对照组(C组)、糖尿病组(DM组)，糖尿病+Ang-(1-7)组〔DM+Ang-(1-7)组〕及糖尿病+Ang-(1-7)+A-779组〔DM+Ang-(1-7)+A-779组〕，每组各10只。建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h后，糖尿病组按60 mg/kg剂量一次性腹腔注射1%STZ，正常组注射等量生理盐水。血糖稳定3 d后，尾静脉随机血糖≥16.7 mmol/L视为建模成功标准。成模后第11周，各组均进行Morris水迷宫测试，之后行侧脑室注射，持续1 w，所有实验大鼠再次进行水迷宫测试。实验终末，糖尿病+Ang-(1-7)组死亡1只，糖尿病+Ang-(1-7)+A-779组大鼠死亡2只。

1.2.2 Morris水迷宫测试 糖尿病大鼠成模后第11周，行Morris水迷宫测试，记录大鼠寻找平台的时间，即逃避潜伏期，评价学习能力和观察120 s内大鼠穿越平台位置的次数，评价记忆能力，经水迷宫图像自动采集和处理系统对各参数进行分析。Ang-(1-7)及A-779干预1 w后重复上述实验。

1.2.3 侧脑室注射 糖尿病大鼠建模成功后第11周，水迷宫测试完毕即行Ang-(1-7)及A-779干预。大鼠腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪下，沿颅顶正中线剪开皮肤，剥离骨膜，暴露颅骨。大鼠侧脑室穿刺定位:前囟后1.0 mm，右1.5 mm，深3.5 mm，微型电钻沿此穿刺钻孔，将带内芯的不锈钢套管(外径0.9 mm，内径0.5 mm)垂直插入侧脑室内，固定套管，缝合伤口，术后大鼠均给予青霉素抗炎。导管置入后第4天行侧脑室注射。①对照组和糖尿病组注射等量生理盐水;②糖尿病 +Ang-(1-7)组:微量注射器3 min内将 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)缓慢匀速注入侧脑室，留针约1 min;③糖尿病+Ang-(1-7)+A-779组:微量注射器 3 min内将 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)和 A-779(50 nmol，1 μl)缓慢匀速注入侧脑室，留针约1 min;各组每天给药1次，持续7 d。

1.2.4 RT-PCR行为学测试后，大鼠断头，冰台上快速取出海马组织，液氮冻存，按照RNA提取试剂说明书提取海马组织的总 RNA。逆转录体系为 20 μl，反应条件:42℃ 10 min，30℃20 min，90℃ 5 min，冰浴5 min。PCR扩增:IDE上游引物序列:5'-CGGGGCCAGGAAAGCAGTCTC-3'，下 游 引 物 序 列:5'-GCGATGCTCTGCTGGTTCAC-3'，扩增长度405 bp;GAPDH上游引物序列:5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物序列:5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'，扩增长度 159 bp。反应体系:RT 产物 2.0 μl，上下游引物各1 μl，2 × Tap PCR master mix 10 μl，补充 DEPC 水至 20 μl。反应条件:94℃ 5 min;94℃30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环;72℃ 10 min。取以上 PCR产物5 μl行琼脂糖凝胶电泳，利用图像分析系统对DNA条带进行激光度扫描，凝胶分析软件进行灰度分析，最后以目的基因与内参的灰度比值来表示目的基因mRNA表达的相对含量。

1.2.5 Western印迹 称取-80℃冰箱保存的海马组织块100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl PMSF，超生细胞破碎仪低温匀浆，离心后BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白质转膜，免疫印迹，ECL显影后条带经凝胶成像软件分析，以 IDE与GAPDH条带灰度比值表示IDE蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试结果 与对照组比较，DM组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)，穿越平台次数明显减少(P＜0.05)。与DM组比较，DM+Ang-(1-7)组逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)，穿越平台次数明显增加(P＜0.05)。与DM+Ang-(1-7)组比较，DM+Ang-(1-7)+A-779组逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)，穿越平台次数明显减少(P＜0.05)。见表1。

2.2 RT-PCR结果 与对照组比较，DM组大鼠海马IDE mRNA的表达水平明显下降(P＜0.05);与DM组比较，DM+Ang-(1-7)组IDE mRNA的表达水平明显升高(P＜0.05)。与DM+Ang-(1-7)组比较，DM+Ang-(1-7)+A-779组 IDE mRNA的表达水平明显减少(P＜0.05)。见图1，表2。

2.3 Western印迹结果 与对照组比较，DM组大鼠海马IDE蛋白表达水平明显下降(P＜0.05);与DM组比较，DM+Ang-(1-7)组IDE蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。与 DM+Ang-(1-7)组比较，DM+Ang-(1-7)+A-779组IDE蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)。见图2，表2。

图1 RT-PCR检测各组大鼠海马IDE mRNA表达

图2 Western印迹检测各组大鼠海马IDE蛋白表达

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试结果(s)

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试结果(s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与DM组比较:2)P＜0.05;与DM+Ang-(1-7)组比较:3)P ＜0.05，下表同

组别 n 穿越平台次数 逃避潜伏期(s)10 6.10±2.38 28.34±8.06 DM组 10 3.10±1.791) 54.43±9.771)DM+Ang-(1-7)组 9 5.89±1.452) 31.24±7.572)DM+Ang-(1-7)+A-779组 8 3.00±2.203) 55.93±7.943)对照组

表2 各组大鼠海马IDE mRNA及蛋白表达水平(s)

表2 各组大鼠海马IDE mRNA及蛋白表达水平(s)

IDE/GAPDH 10 0.65±0.09 0.56±0.08 DM组 10 0.40±0.081) 0.32±0.071)DM+Ang-(1-7)组 9 0.62±0.112) 0.52±0.102)DM+Ang-(1-7)+A-779组 8 0.38±0.063) 0.31±0.083)蛋白对照组组别 n IDE/GAPDH mRNA

3 讨论

近年来的研究显示，大脑肾素-血管紧张素系统(RAS)参与了学习记忆等认知功能的调节〔3～5〕，如:AngⅡ可以抑制海马LTP效应、抑制大脑神经递质乙酰胆碱的释放、激活氧化应激以及减少中枢血流;AngⅣ可以促进胆碱乙酰转移酶的表达增多、易化海马LTP效应。Ang-(1-7)作为RAS中最重要的血管紧张素肽段，主要由ACE2分解AngⅡ而来，Ang-(1-7)及其功能性受体Mas在大鼠海马、下丘脑和齿状回颗粒细胞等都有丰富的表达〔6〕。Ang-(1-7)与Mas受体结合能够舒张脑血管改善中枢血流、易化海马LTP效应、调节类胆碱突触，表明其在学习记忆等认知功能方面具有重要作用〔2，7〕。糖尿病大鼠认知功能的受损程度与Aβ的表达呈正相关〔8〕，IDE作为Aβ的高效降解酶，参与了海马Aβ的降解。本研究结果表明，Ang-(1-7)可以通过上调海马IDE mRNA及蛋白的表达，改善糖尿病大鼠的认知功能，推测其可能的途径与IDE表达上调，海马Aβ的降解增加，从而减轻Aβ的沉积有关。

1 Malaplate Armand C，Florent Bechard S.Soluble oligomers of amyloid-β peptide induce neuronal apoptosis by activating a cPLA2-dependent sphingomyelinase-ceramide pathway〔J〕.Neurobiol Dis，2006;23(1):178-89.

2 Hellner K，Walther T，Schubert M，et al.Angiotensin-(1-7)enhances LTP in the hippocampus through the G protein-coupled receptor Mas〔J〕.Mol Cell Neurosci，2005;29:427-35.

3 张栋珉，肖 谦.肾素血管紧张素系统与糖尿病脑病〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2008;28(6):384-6.

4 张栋珉，肖 谦，李 娟.血管紧张素Ⅳ对糖尿病大鼠胆碱乙酰转移酶表达及认知功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(9):1243-5.

5 Bonini JS，Bevilaqua LR，Zinn CG，et al.AngiotensinⅡdisrupts inhibitory avoidance memory retrieval〔J〕.Hormones Behav，2006;50:308-13.

6 Alenina N，Xu P，Rentzsch B，et al.Genetically altered animal models for Mas and angiotensin-(1-7)〔J〕.Exp Physiol，2007;93(5):528-37.

7 Evi Kostenis，Graeme Milligan，Arthur Christopoulos，et al.G-protein-coupled rece-ptor mas is a physiological antagonist of the angiotensinⅡtype 1 receptor〔J〕.Circulation，2005;111:1806-13.

8 蔡志友，晏 勇，张 骏.β-淀粉样前体蛋白与β-淀粉样蛋白在糖尿病大鼠脑组织中的表达意义及行为学相关性研究〔J〕.中国医科大学学报，2008;37(5):644-7.