LXRα-shRNA真核表达质粒的构建及抑制LXRα表达的有效序列筛选

张 琴 彭 俊 沈 薇 (重庆医科大学附属第二医院消化内科，重庆 40000)

肝X受体(LXRs)可参与机体多种生理活动调节，包括脂肪代谢、胆固醇代谢等〔1，2〕。LXRs包括 LXRα 和 LXRβ 两种亚型，其中前者主要表达于肝脏、脂肪组织等，后者广泛表达于全身各组织〔3〕。在肝脏，LXRα是脂代谢的关键调控点，近年来研究显示乙肝病毒X蛋白(HBx)可通过与LXRα相互作用调节参与脂肪酸和甘油三酯的酶如脂肪酸合酶(FAS)等的转录，从而引起脂代谢紊乱和肝细胞脂肪变性〔4〕。RNA干扰(RNAi)技术是近年来发展起来的一项特异性抑制基因表达的新方法，具有特异性、转染效率高、作用强等优点，已广泛用于抗病毒抗肿瘤等研究〔5〕。我们前期实验提示HBx可以上调LXRα的表达引起肝细胞脂肪变，为了进一步研究HBx的作用机制，本研究拟构建能产生针对LXRα基因的短发夹小干扰RNA(shRNA)真核表达质粒，并用构建质粒转染HepG2.2.15细胞，筛选出高效沉默LXRα基因的序列，将对研究乙肝合并肝脂肪变的发生机制提供有力的工具。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 载体pGenesil-1.1(含hU6启动子、Kan/Neo抗性、EGFP荧光)及大肠杆菌 DH5α(武汉晶赛公司);HepG2.2.15细胞由本实验室保存;T4DNA连接酶、限制性内切酶Eco31I和SacI(Takara公司);通用阴性对照质粒(武汉晶赛公司);质粒小抽提试剂盒(BioRad公司);凝胶DNA回收试剂盒(美国Promega公司);转染试剂PolyJetTM(SignaGen公司);小鼠抗人LXRα单克隆抗体(Abcam公司);山羊抗小鼠β-actin抗体(北京天根公司);总RNA抽提及逆转录试剂盒(Bioteke公司);核蛋白提取试剂盒(凯基生物)，胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶序列的选择 在GenBank中找到LXRα mRNA基因序列(基因NM号:001130101)，通过www.genscript.com网站，根据RNA干扰设计原则设计三个siRNA作用的靶序列(表1)。

1.2.2 LXRα基因的shRNA真核表达质粒的构建 转录模板合成的引物结构为CACC+Sense+Loop+Antisense+终止信号 +SacI，构建质粒载体插入的DNA模板序列见表2。模板中loop结构选用了TTCAAGACG以避免形成终止信号，转录终止采用T6结构(正义链和反义链由上海生工公司合成)。合成 DNA oligo 分别用 30 μl annealing buffer溶解，再各取 2 μl与16 μl annealing buffer混匀，94℃水浴退火自然冷却至室温，各取1 μl退火产物加入99 μl H2O做100倍稀释。退火处理后的shRNA模板用于连接反应。

表1 LXRα基因的shRNA序列

表2 LXRα基因shRNA表达载体的模板序列

1.2.3 酶切和连接反应 质粒载体pGenesil-1.1用Eco31Ⅰ酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。稀释退火片段分别与线性化的pGenesil-1.1质粒表达载体连接。连接反应条件:取稀释退火片段 1 μl，线性化质粒载体 1 μl，10 × ligase buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，H2O 6 μl，置于 37℃水浴过夜。

1.2.4 重组质粒载体的转化、筛选 各取5 μl过夜的链接产物转化感受态细胞DH5α，分别涂布与含kana抗性(终浓度为30 μg/ml)的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含kana抗性卡那抗性(终浓度为30 μg/ml)的LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜。质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，保存于-20℃冰箱备用，分别用SacI做酶切鉴定。酶切反应条件:质粒DNA8.5 μl，10×ligase buffer 1 μl，SacI 0.5 μl，37℃水浴反应 3 h。

1.2.5 重组质粒鉴定 ①酶切鉴定酶切后产物经1%Agarose凝胶电泳，EB染液染色10 min，紫外灯观察结果。②测序鉴定扩增菌液送上海生工公司测序。

1.2.6 细胞培养和分组HepG2.2.15细胞培养于含15%胎牛血清、200 μg/mlG418的 RPMI-1640培养基，37℃、5%二氧化碳孵箱培养，每2～3天用25%胰酶消化传代细胞分为5组，第1组为空白对照组;第2组为阴性对照组(HK组);第3、4、5组分别为 shRNA-LXRα1组、shRNA-LXRα2组、shRNA-LXRα3组。

1.2.7 质粒转染 待细胞长至80%～90%融合时接种于6孔板，次日按转染试剂说明书操作步骤转染细胞。第1组未转染任何质粒;第2 组以转染试剂 PolyJetTM 4 μl∶1.5 μg HK 质粒转染细胞;第 3、4、5 组分别以 PolyJetTM 4 μl∶1.5 μg LXRα1、LXRα2、LXRα3质粒DNA转染细胞。转染后10～18 h细胞换液。48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。并计算转染效率。EGFP为绿色荧光标志物，故根据细胞内绿色荧光的数量可以判断转染阳性细胞的数量〔6〕。白光下固定一视野，细胞总数计数，再转换荧光光源计数携带绿色荧光的细胞数，则转染效率(%)=有荧光表达的细胞数/细胞总数×100%，每孔细胞随机选取5个视野，重复3次，取其平均值。

1.2.8 RT-PCR检测LXRα mRNA的表达 细胞转染48 h后抽提各组细胞的总RNA，逆转录获得cDNA，再以5 μl cDNA为模板，扩增 LXRα基因片段。LXRα基因引物为:上游:5'-GGAACAACTGGGCATGATCG-3'，下 游:5'-ATAGCAATGAGCAAGGCAAACT-3'。产物长度:462 bp。β-actin引物为:上游:5'-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3'，下 游:5'-TTGATCTTCATGGTGATAG GAGCGAGGGCA-3'。 产 物 长 度:259 bp。PCR反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃终延伸2 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，相对表达量用LXRα与β-actin灰度值的比值表示，采用Quantity-one软件进行半定量分析。

1.2.9 Western印迹检测LXRα蛋白的表达 质粒转染48 h后，细胞用胰酶消化，4℃离心，5 min收集细胞，预冷PBS洗3次，根据核蛋白提取试剂盒操作步骤提取各组细胞核蛋白。BCA法测定蛋白浓度，-70℃保存。上样前蛋白样品与等量2×蛋白处理液混匀，煮沸5 min，上样到12%SDS-PAGE中，每孔按100 μg上样，电泳分离后转至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉摇床上封闭1 h，加入LXRα抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜，次日PBST漂洗三次后加入二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，ECL显色。用LXRα与内参灰度比值表示LXRα蛋白的相对表达量，Quantity-one软件比较后进行半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件，实验数据用s表示。多样本均数比较用方差分析。

2 结果

2.1 重组质粒的酶切及测序 质粒pGenesil-1.1的多克隆位点(MCS)如下:-MluI-hU6 promoter-Insert DNA-SacI-，在插入的目的基因片段里，我们分别设计了一个SacI的酶切位点，而质粒载体pGenesil-1.1本身有一个SacI的酶切位点，若插入正确，质粒就能被SacI酶切出一条约916 bp的DNA小带。经酶切鉴定分析三条重组质粒均符合设计要求(图1)，送转化菌液测序插入的片段碱基序列完全符合设计要求。

图1 重组质粒酶切图谱

2.2 细胞转染效率 阴性对照组和转染重组质粒的三组细胞内均可见绿色荧光，未转染质粒的空白对照组细胞内未见荧光(图2);HK转染组及 shRNA-LXRα1组、shRNA-LXRα2组、shRNA-LXRα3组平均转染效率分别为:79.21% ±0.06%、79.19±0.0798%、79.24% ±0.08%、79.10% ±0.13%，各组细胞间转染效率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 RT-PCR检测结果 空白对照组、HK组、shRNA-LXRα1组、shRNA-LXRα2组和 shRNA-LXRα3组 LXRα/β-actin比值分别为:0.83±0.02、0.84±0.03、0.28±0.03、0.52±0.04、0.53±0.03。与空白对照组和 HK 组比较，LXRα1、LXRα2和 LXRα3组中 LXRα mRNA表达较低，且 LXRα1组表达量明显低于LXRα2和LXRα3组(P＜0.05)(图3)。

图2 荧光显微镜观察各组细胞转染效率(×100)

2.4 Western印迹检测结果 空白对照组、HK组、shRNALXRα1组、shRNA-LXRα2组和 shRNA-LXRα3组电泳条带灰度值 LXRα/β-actin比值分别为:0.78±0.02、0.77±0.03、0.30±0.03、0.54 ±0.02、0.53±0.02。其中 LXRα1、LXRα2 和 LXRα3组LXRα蛋白表达低于空白对照组和HK组，且LXRα1组表达量明显低于LXRα2和LXRα3组(P＜0.05)(图4)。

图3 各组细胞LXRα mRNA的表达

图4 各组细胞内LXRα蛋白的表达

3 讨论

LXRs是一种可以通过结合配体而激活的转录因子，属于核受体家族成员，其主要包括LXRα和LXRβ两个亚型，二者具有相同的核受体结构〔7，8〕，LXRβ 表达广泛，而 LXRα 仅在与脂代谢密切的肝脏、小肠、脂肪和巨噬细胞中高表达。LXRs与脂肪代谢有密切关系，被认为是全身脂质代谢的感受器之一，它可以上调SREBP1c的表达从而调节多种参与脂肪酸和甘油三酯合成的酶的转录，包括FAS、ACC等，从而导致宿主细胞脂代谢紊乱和脂肪变性〔9〕。研究显示LXRs激动剂可导致肝脏内的脂肪沉积和血浆中甘油三酯水平升高，甚至发生肝脂肪变性，说明LXRs在肝脂肪变中起重要作用。近年来研究证实病毒性肝炎常合并不同程度的肝脂肪变，我们前期实验提示乙肝病毒X蛋白(HBx)是乙肝合并肝脂肪变的主要病毒因素，且可能通过上调LXAα起作用，但其作用机制尚不明了。RNAi技术，是近几年来出现的一种转录后水平的基因沉默技术，许多研究表明RNAi有很强的抑制目的基因的作用，具有稳定性高、特异性强、效果显著等优点，被认为是PCR技术之后又一划时代的基因工程方法。目前RNAi已经广泛用于抗病毒、抗肿瘤及疾病的基因治疗的研究，并取得了良好的应用前景〔10〕。HepG2.2.15细胞系是将克隆的HBV DNA及含有新霉素抗性基因的质粒导入人肝癌细胞建立的细胞株，它可以持续表达HBx。为了进一步研究HBx参与肝脂肪变性的作用机制，本研究拟用HepG2.2.15细胞为研究对象，构建靶向LXAα的shRNA真核表达质粒，为下一步研究提供基础。

本实验中的质粒载体是带有EGFP绿色荧光蛋白的，质粒转染后直接在荧光显微镜下观察绿色荧光即可判断转染效率。高效的靶基因RNAi序列和通过有效的方法将质粒导入细胞是RNAi成功的关键〔11〕，本研究设计的RNA干扰序列是根据通过计算机网络和Tuschl新算法的设计原则设计的，通过酶切和测序鉴定提示序列的设计是完全符合要求的。以适宜比例的PolyJetTM和质粒瞬时转染入细胞，实验发现细胞转染后48 h绿色荧光蛋白的表达最高，且转染效率都在78%以上，说明质粒成功导入细胞，且我们设计合成的三条质粒均能有效抑制LXRα mRNA及蛋白的表达，以shRNA-LXRα1沉默效果最好，我们的研究为进一步探索HBx对肝细胞脂肪变性的作用机制奠定了坚实的基础。

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