碱性纤维母细胞生长因子对阿尔茨海默病细胞模型ERK1/2和PKCγ活性的影响

吴 哲 赵艳华 彭 博 罗晓光 罗小萌 (中国医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 沈阳 000)

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可促进大脑皮质、海马、小脑以及多巴胺能、骨髓和感觉神经元存活〔1〕。FGF受体(FGFR)属酪氨酸激酶受体家族中成员，介导FGF信号进入细胞，由 bFGF/FGFR介导的信号转导途径包括:PKC〔2〕、Ras-RafMEK-ERK〔3〕、JAK-STAT〔4〕和 PI3K 途径〔5〕。有研究显示，阿尔茨海默病(AD)患者大脑神经元蛋白激酶C(PKC)表达异常减少和ERK1/2表达异常增加〔6〕。MAPK/ERK级联激活是AD早期病生理学特征，可能参与神经元退行性变的自我刺激过程，以及这些条件下的错误修复〔7〕。目前，尚无有关bFGF对AD模型细胞PKCγ和ERK1/2表达和活性影响的文献报道，我们采用Aβ25-35诱导PC12细胞建立AD细胞模型，以探讨bFGF对AD模型细胞PKCγ及ERK1/2表达和活性的影响，可望为其临床治疗提供新的思路与途径。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 PC12细胞株购自中科院上海细胞库。每3天换液1次，5～6 d传代1次。

1.2 试 剂 与 药 品 Aβ25～35，MTT，DMSO(Sigma 公 司)，PD98059(美国Promega公司)，一抗为兔抗鼠P-ERK1/2单克隆抗体和兔抗鼠PKCγ单克隆抗体(美国SANTA公司)，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG HRP(北京中山生物技术有限公司，进口分装)，bFGF(北京博奥森生物技术有限公司)，硝酸纤维素膜(美国Millipore公司)，凝胶上样缓冲液，十二烷基磺酸钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺、甲醇、显影液、定影液、丙酮、二甲苯、无水乙醇、甲醛、脱脂奶粉(华美公司)，胎牛血清、马血清、胰蛋白酶，PRMI-1640培养液(Gibco公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 PC12细胞培养及分组 置于PRMI-1640培养基，37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育，3 d换液1次，进行分组。(1)正常对照组:取对数生长的PC12细胞培养48 h。(2)Aβ损伤组:取对数生长的PC12细胞加入终浓度为20 μmol/L的Aβ25～35培养液，培养48 h。(3)bFGF组:取对数生长的PC12细胞加入含bFGF(终浓度分别为25、50、75和100 ng/L)及肝素(终浓度为80 ng/L)培养液，2 h后滴加 Aβ25～35(终浓度为20 μmol/L)培养48 h。(4)PD98059抑制剂组:取对数生长的PC12细胞加入含PD98059培养液终浓度分别为25、50、75和100 μmol/L，60 min 后滴加 bFGF(终浓度 50 ng/L)，培养至120 min滴加 Aβ25～35及肝素(终浓度 80 ng/L)，培养 48 h。

1.3.2 MTT法检测PC12细胞存活率 取对数生长期PC12细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，以105个细胞/孔接种于96孔细胞培养板，每孔滴加1640培养基200 μl，置37℃、体积分数为5%CO2培养箱培养24 h，弃原培养液、以无血清培养基冲洗两次，分别于对照组、Aβ损伤组和bFGF组、空白对照(不加细胞)，每孔滴加 MTT 20 μl、37℃继续培养4 h，倒出培养液、加入DMSO 150 μl，振荡摇匀、室温静置30 min，以空白对照组调零，酶标仪于570 nm处读取不同处理组细胞吸光值(OD值)，每组实验设定3个复孔，取平均值。

1.3.3 Western印迹法检测p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达 不同处理组PC12细胞(约5×106)，置于预冷100 μl细胞裂解液、超声粉碎，离心1 h后采集上清液，改良酚试剂法测量不同处理组蛋白水平。每组取总蛋白40 μg，于10%(W/V)聚丙烯酰胺凝胶溶液中进行电泳1.5～2 h，电压50 V转印2 h后转移至硝酸纤维素(NC)膜上;TBST溶液清洗NC膜，置含5%(W/V)脱脂奶粉 TTBS溶液中、4℃封闭过夜;TTBS溶液清洗，加入p-ERK1/2和 PKCγ(I抗，1∶800)，室温下孵育 2 h，TBS 液洗膜后加入山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，ECL试剂显带X线片曝光，显影定影后扫描，电泳带的灰度用Band Scan软件分析，以β-actin灰度值之比作为半定量结果。

1.4 统计分析方法 采用SPSS12.0统计软件进行数据计算与分析。实验数据以s表示，不同样本均数f刚的比较行单因素方差分析(ANOVA)和两两比较的q检验。使用相关分析分析药物浓度与细胞存活率之间的关系。

2 结果

2.1 不同处理组PC12细胞存活率 Aβ损伤组OD值及细胞存活率显著低于与对照组(P=0.02)，而bFGF组OD值及细胞存活率则显著高于Aβ损伤组(P=0.01)，Pearson相关分析显示细胞存活率与bFGF药物浓度呈正相关(r=0.08，P=0.01)。提示bFGF具有神经元保护和拮抗Aβ毒性作用。见表1。

图1 正常对照组和Aβ损伤组PC12细胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达变化

图2 bFGF组和Aβ损伤组PC12细胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达变化

表1 不同处理组PC12细胞OD值及细胞存活率的比较(s)

表1 不同处理组PC12细胞OD值及细胞存活率的比较(s)

与对照组比较:1)P＜0.05;与Aβ损伤组比较:2)P＜0.05，下表同

组别 OD值 细胞存活率(%)2.532±0.22 100.00±8.69 Aβ损伤组 1.678±0.161) 66.27±6.321)bFGF组(25 ng/L)1.863±0.142) 73.58±5.532)bFGF组(50 ng/L)1.967±0.232) 77.69±9.082)bFGF组(75 ng/L)2.042±0.182) 80.64±7.112)bFGF组(100 ng/L)2.157±0.122) 85.19±4.742)对照组

表2 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

表2 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

与对照组比较:1)P＜0.05

组别 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ

2.2 ERK1/2(p-ERk1/2)和PKCγ蛋白表达量变化 如图1和表2所示，与正常对照组比较，Aβ损伤组p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达均显著下降(P＜0.05)，表明 Aβ25～35具有抑制PC12细胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达作用。由图2和表3可见，bFGF组p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达水平高于 Aβ损伤组(P＜0.05)，提示bFGF具有增强AD模型细胞ERK1/2活力的作用，且与bFGF药物浓度呈正相关(r=0.785，P=0.01)。图3和表4显示，抑制剂组PC12细胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达量显著低于bFGF组(P＜0.05)，并与PD98059药物浓度呈正相关(r=0.85，P=0.01)。说明bFGF增强AD模型细胞ERK1/2活力和PKCγ蛋白表达的作用可被PD98059所抑制。

图3 抑制剂PD98059各亚组和bFGF(50 ng/ml)组PC12细胞p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达量变化

表3 p-ERE1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

表3 p-ERE1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

与Aβ损伤组比较:1)P＜0.05

组别 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ 100.65±23.64 113.45±22.35 89.98±19.75 25 ng/ml bFGF组112.37±21.161)119.67±22.072)114.67±21.343)50 ng/ml bFGF组125.45±22.631)135.85±21.442)129.43±19.653)75 ng/ml bFGF组141.52±22.561)148.08±23.172)151.48±15.253)100 ng/ml bFGF组195.33±28.321)199.93±29.132)205.77±26.453)F值Aβ损伤组39.68 38.52 25.42

表4 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

表4 p-ERK1/2和PKCγ蛋白表达灰度值分析(s)

与bFGF组比较:1)P＜0.05

组别 p-ERK1 p-ERK2 PKCγ 1

3 讨论

PKC是Ca2+-磷脂依赖性丝-苏氨酸蛋白激酶，为酪氨酸蛋白激酶下游分子。激活后可引起多种细胞内磷酸化，从而启动和调节信号转导，如突触可塑、神经递质释放，其中包括GABA等;还可激活Bcl-2而产生抗凋亡作用。研究表明，ERK1/2信号转导途径在中枢神经系统呈广泛表达，各种细胞外刺激信号均可通过ERK1/2通路影响突触传递和神经元重塑、形态分化和生存等，参与中枢神经系统多种疾病的病理过程〔8〕。本实验证实，bFGF可抑制Aβ25～35对PC12细胞的损伤作用，这一保护作用的可能机制是通过影响PKCγ蛋白表达和ERK1/2活性而实现的，为bFGF通过PKCγ和ERK1/2信号途径治疗AD提供实验依据。

1 Raballo R，Rhee J，Lynock R，et al.Basic fibroblast growth factor FGF2 is necessary for cell proliferation and neurogenesis in the developing cerebral codex〔J〕.J Neurosci，2000;20(13):5012-23.

2 Schlessinger J.Cell signaling by receptor tyrosine kinases〔J〕.Cell，2000;103(2):211-25.

3 Boilly B，Vercoutter-Edouan AS，Houdermarck H，et al.FGF signals for cell proliferation and migration through different pathways〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2000;11(4):295-302.

4 Kisseleva T，Bhattacharya S，Braunstein J，et al.Signaling through the JAK/STAT pathway，recent advances and future challenges〔J〕.Gene，2002;285(1-2):1-24.

5 Laine J，Kunstle G，Obata T，et al.Differential regulation of akt kinase isoforms by the members of the TCLl oncogene family〔J〕.J Biol Chem，2003;277(5):3743-51.

6 Shinohama S，Matsushima H.Signal transduction mechanisms in Alzheimer disease〔J〕.Alzheimer Dis Assoc Dis，1995;2(1):15-22.

7 Arendt T，Holzer M，Grobmann A，et al.Increased expression and subcellular translocation of the mitogen activated protein kinase in Alzheimer disease〔J〕.Neuroscience，1998;68(1):5-18.

8 Sundararajan S，Gamboa JL，Victor NA，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor-γ ligands reduce inflammation and infarction size in transient focal ischemia〔J〕.Neuroscience，2005;130(3):685-96.