黄梅木提取物对皮肤过敏大鼠腹腔肥大细胞活化的影响

李良昌 延光海 李光昭 沈光海 (延边大学医学部解剖学教研部，吉林 延吉 33000)

肥大细胞膜表面表达IgE高亲和力受体，经活化后可产生和释放多种炎性介质，从而引起多种变态反应症状。炎症反应与肥大细胞脱颗粒密切相关，也是过敏反应过程中的关键步骤，抑制肥大细胞脱颗粒和释放组胺可减轻炎症反应的强度〔1〕。黄梅木(别名檀香梅)在中国的辽宁、山西、陕西、甘肃、山东、江苏、安徽、江西、湖北、四川等省亦广泛分布，名为三钻风、甘姜、香丽水等，以树皮人药，主治跌打损伤、瘀血肿痛;外用鲜树皮捣烂敷患处〔2〕。本实验探讨黄梅木提取物对肥大细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重为200～250 g的健康成熟SD雄性大鼠(延边大学医学部动物室提供，动物质量合格证:10-1022)。室温(22±1)℃、相对湿度50% ～60%、光照周期12/12 h环境中适应饲养1 w后实验。

1.2 试剂 Anti-DNP IgE、DNP人血清蛋白(HSA)、MTT、组胺检测试剂盒、同位素Ca2+、氮卓斯汀、抗actin抗体以及HEPES均购自美国 Sigma公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、抗核转移因子(NF-κB)p65多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品。

1.3 主要仪器 酶联免疫检测仪(RT-2100C，美国)，CO2培养箱(TC23232E，美国)，电泳仪及电泳槽(E-C Apparatus Corporation，美国)，Western印迹转膜仪(BioRad公司)，核酸/蛋白质含量测定仪(SmartSpec Plus)，高速冷冻离心机(TGL-16G)，RF-540型荧光分光光度计(日本岛津公司)。

1.4 方法

1.4.1 黄梅木提取物制备方法 取干燥的黄梅木树枝1 000 g(延边大学药学院提供)加3 500 ml 70%乙醇，用加热萃取机萃取4 h，将取得的萃取液用滤纸滤过，然后使用回转真空浓缩机，上清液在45℃减压浓缩，经冷冻干燥得粉末80 g，临用前以蒸馏水或生理盐水配制。

1.4.2 腹腔肥大细胞的获取 腹腔肥大细胞的分离提纯是采用 Choi等〔3〕的方法。

1.4.3 被动皮肤过敏反应(PCA)实验〔4〕将健康SD大鼠随机分为6组:包括正常对照组，模型对照组，黄梅木提取物低、中、高剂量组(100、200、400 mg/ml)及阳性药物对照组(氮卓斯汀，10 mg/ml)，每组10只大鼠。大鼠背部皮内注射200 ng anti-DNP IgE，24 h后大鼠阴部静脉注射含有100 μg DNP HSA的1%伊文思蓝混合液200 μl。注射伊文思蓝前24、12、1 h黄梅木提取物高、中、低剂量灌胃治疗。30 min后，切开背部皮肤蓝色斑点部位，称量，细切放入HERES-Tyrode溶液在60℃干燥机水浴箱上放置3 h。用分光光度计在620 nm下测定渗出的伊文思蓝浓度。

1.4.4 细胞毒性实验 利用MTT进行检测黄梅木提取物的细胞毒性〔3〕。

1.4.5 肥大细胞组胺释放量测定〔3〕在肥大细胞悬液中加入anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃孵育6 h。然后，分别加入黄梅木提取物高、中、低剂量(100、50、25 μg/L)组，氮卓斯汀(10 μg/L)作为阳性对照，作用10 min，洗净，各组分别加入DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min，离心后取适量细胞上清液分别用于测定组胺。

1.4.6 肥大细胞内钙摄入量测定〔5〕在肥大细胞悬液中，放入含有 1 μCi45Ca2+/ml的 HERES-Tyrode缓冲溶液(MgCl2、CaCl2除外)，再悬浮。加入 anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃孵育6 h，分别加入黄梅木提取物和阳性对照氮卓斯汀，作用10 min，洗净，各组分别加入 DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min。离心后除去上层液，用Triton-100破坏肥大细胞，计算出钙离子量。

1.4.7 TNF-α、IL-6蛋白测定〔6〕在腹腔肥大细胞中加入anti-DNP IgE(10 μg/L)致敏，在37℃培养基孵育6 h，换洗后，加入黄梅木提取物作用10 min，洗净，各组分别加入DNP-HSA(100 ng/ml)，孵育30 min。离心后除去上层液，加入裂解液，4℃离心，取上清液测蛋白浓度。取20 μg蛋白，经12%SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉Tris-缓冲液(TBST)溶液室温下封闭2 h，分别加入TNF-α及IL-6抗体4℃过夜，洗膜后再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗杂交，37℃，1 h。洗膜后在暗室中加增强化学发光法(ECL)试剂，显影及定影。

2 结果

2.1 黄梅木提取物对PCA的影响 与模型组比较黄梅木提取物各治疗组均能减少染料的渗出，其中高、中(400、200 mg/kg)剂量组与模型组比较差异显著(P＜0.05)。见表1。

2.2 MTT测定结果 上述实验所用黄梅木提取物25～100 μg/L浓度对肥大细胞活性几乎无影响。见表2。

2.3 黄梅木提取物对肥大细胞组胺生成和钙摄入量影响 与模型组比较黄梅木提取物各治疗组均能抑制组胺生成和钙摄入量，其中高、中(100、50 μg/L)剂量组与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。见表2。

2.4 黄梅木提取物对TNF-α蛋白表达的影响 Western印迹条带光密度分析显示模型组TNF-α蛋白表达较对照组增加9.3 倍，黄梅木提取物(25、50、100 μg/L)给药 10 min 使 TNF-α蛋白表达分别下降7.8%、81%与87%。见图1。

2.5 黄梅木提取物对IL-6蛋白表达的影响 Western印迹条带光密度分析显示模型组 IL-6蛋白表达较对照组增加10倍，黄梅木提取物(10、25、50 μg/L)给药10 min使 IL-6蛋白表达分别下降8.6% 、84%与87%。见图2。

表1 黄梅木提取物对被动皮肤过敏反应的影响( s，n=8)

表1 黄梅木提取物对被动皮肤过敏反应的影响( s，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.05;下表同

组别 剂量(mg/kg)伊文思蓝(μg/g)抑制率(%)0 56.25±2.65 -模型组 0 301.65±17.23 -黄梅木提取物组 100 266.32±13.81 14.51黄梅木提取物组 200 184.56±13.69 39.131)黄梅木提取物组 400 131.92±5.35 59.811)氮卓斯汀组 10 115.69±7.63 62.171)正常组

表2 黄梅木提取物对肥大细胞释放组胺生成和钙摄入量的影响( s，n=5)

表2 黄梅木提取物对肥大细胞释放组胺生成和钙摄入量的影响( s，n=5)

0 1.41±0.70 0.12±0.10 41.52±2.10模型组 0 1.38±0.72 1.32±0.14 150.86±4.96黄梅木组 25 1.41±0.52 1.14±0.15 129.81±4.87黄梅木组 50 1.47±0.59 0.79±0.231) 87.10±3.711)黄梅木组 100 1.48±0.75 0.31±0.311) 67.41±3.361)氮卓斯汀组 10 1.48±0.69 0.29±0.191) 55.63±2.911))正常组

图1 不同药物组肥大细胞TNF-α蛋白免疫印迹

图2 不同药物组肥大细胞IL-6蛋白免疫印迹

3 讨论

抗原致敏机体后，机体免疫系统可对其进行识别并产生特异性抗体IgE，IgE可与肥大细胞表面的高亲合性IgE Fc受体(FceRI)结合使细胞致敏。当机体再次接触抗原时，特异性IgE可与其结合，活化FceRI，从而诱导肥大细胞脱颗粒并释放多种炎性介质〔5〕。因此，如何有效地抑制肥大细胞脱颗粒就成为抗变态反应药物研发的重点。

被抗原激活的肥大细胞脱颗粒以后，释放出TNF-α、IL-6等与Ⅰ型变态反应相关的细胞因子，然后引起过敏炎症反应〔6〕。TNF-α可由多种细胞合成，是重要的前炎症因子，它可促使血管内皮细胞表达黏附分子促进炎症细胞的聚集，并可刺激前列腺素、白三烯等因子的释放。组胺可增强多种细胞合成分泌IL-6等促炎细胞因子，促进过敏炎症反应;组胺还可增强嗜酸细胞和肥大细胞的趋化反应，诱导炎症介质的生成，对炎症有促进作用〔1〕。据研究报道，调节细胞内钙的浓度是抑制FceRI诱导肥大细胞脱颗粒的关键因素〔7〕。结果显示黄梅木提取物呈剂量依赖性减少IgE诱导的肥大细胞外钙内流，由此可抑制肥大细胞脱颗粒和炎症细胞因子的释放;从体内及体外观察到黄梅木提取物抑制肥大细胞脱颗粒的同时，也抑制了组胺、TNF-α、IL-6等与I型变态反应相关的因子，这可能是黄梅木提取物抗I型变态反应的重要机制之一。

近年的研究结果揭示肥大细胞的脱颗粒与Lyn/Syk/LAT及Fyn/Gab2/PI3K两条信号通路密切相关，黄梅木提取物是通过调节其中一条信号通路，还是对两条信号通路均有作用，这将是下一步的研究重点。

1 顾 卫，赵力建，赵爱国.杠柳苷元对肥大细胞脱颗粒及释放组胺影响的研究〔J〕.中国药房，2008;19(3):166-8.

2 魏圣淑，刘向前，吴世旭.韩国药用植物黄梅木果实挥发油成分的GC-MS研究〔J〕.中草药，2004;35(10):1097-8.

3 Choi YH，Yan GH.Silibinin attenuates mast cell-mediated anaphylaxislike reactions〔J〕.Biol Pharm Bull，2009;32(5):868-75.

4 Choi YH，Yan GH，Chai OH，et al.Inhibitory effects of agaricus blazei on mast cell-mediated anaphylaxis-like reactions〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(7):1366-71.

5 Choi YH，Yan GH.Ellagic acid attenuates immunoglobulin E-mediated allergic response in mast cells〔J〕.Biol Pharm Bull，2009;32(6):1118-21.

6 Kovarova M，Rivera J.A molecular understanding of mast cell activation and the promise of anti-allergic therapeutics〔J〕.Curr Med Chem，2004;11(15):2083-91.

7 Chai OH，Lee HK，Lee YC，et al.Roles of TNF-alpha and IgE in the late phase of contact hypersensitivity induced by trimellitic anhydride〔J〕.Exp Mol Med，2005;37(5):408-17.