白藜芦醇对小鼠酒精性肝损伤的抑制作用

周晓云 崔晓明 崔国金 蔡庆艳 韩淑英

(河北联合大学基础医学院 河北唐山 063000;①内蒙古自治区科左后旗人民医院)

醉酒、酗酒会引起身体的不适，大量酒精摄入会造成人体多种器官损害，其中对肝脏的损害尤其严重。随着人民生活水平的提高，酒精性肝病(Alcohol Liver Disease)已经成为继病毒性肝炎后的另外一种多发的肝损伤疾病［1］。但目前为止尚没有一种高效的方法可以减轻酒后反应及饮酒带来的肝损伤。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种广泛存在于自然界多种植物中的多酚类化合物，具有抗氧化、降低血液粘稠度、预防癌症的发生、抗过敏、抗突变、抗验证、调节免疫等药理活性［2］，被广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域［3］。近年研究表明，Res对过氧化氢、四氯化碳、酒精等所致肝损伤具有抑制作用，且对肝纤维化和肝癌的治疗有重要的潜在意义［4～6］。本研究拟通过小鼠酒精性肝损伤模型，研究Res防止酒精性肝损伤的作用机理，为开发利用其类似物提供试验资料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物。SPF级昆明种雄性小白鼠(北京中国医学科学院实验动物研究所，许可证号:SCKX(京)2004-0001)，6～8周龄，体质量18～22 g。常规颗粒饲料喂养，自由饮水，室温22～25℃，相对湿度40% ～70%。

1.1.2 药品与试剂。白藜芦醇(购自中国药品生物制品检定所，批号:110742-200517，纯度99.9%);超氧化物歧化酶SOD测定试剂(南京建成生物工程研究所，批号:20100503)，丙二醛MDA测定试剂(南京建成生物工程研究所，批号:20100503)，考马斯亮兰蛋白测定试剂(南京建成生物工程研究所，批号:20100515)，ALT试剂盒(广州标佳科技公司生产，批号:021129)，AST试剂盒(广州标佳科技公司生产，批号:020926);10%的甲醛由PBS液稀释得到，其它试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器。X-22R低温离心机(德国BECKMAN公司)，MH2000电子水浴恒温槽(北京医疗设备总厂)，酶标仪(BIORAD)，玻璃研磨器(国产);CO2培养箱(型号2123TC);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电子天平(上海菁海仪器有限公司，型号FA2104N);CX9全自动生化分析仪(BECKMAN公司生产);微量移液器eppendorf(Made in USA)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝损伤模型制备级分组给药。实验小鼠适应性饲养1周，随机分成5组，每组12只:①正常组:每天上午、下午分别按照10mL/kg灌胃0.9%生理盐水;②模型组:每天上午按照10mL/kg灌胃0.9%生理盐水，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;③低剂量白藜芦醇给药组:每天上午按照10mL/kg灌胃0.02g/kg白藜芦醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;④中剂量白藜芦醇给药组:每天上午按照10mL/kg灌胃0.04g/kg白藜芦醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇;⑤高剂量白藜芦醇给药组:每天上午按照10mL/kg灌胃0.08g/kg白藜芦醇，下午灌胃10mL/kg，50%的乙醇。各组均连续灌胃10天。

1.2.2 指标检测。上述各组小鼠灌胃期间每天观察精神活动、毛色、饮食、体质量等一般状态;末次给予乙醇后禁食不禁水12h，称重，采用摘眼球取血，3000 r/min离心，取血清按试剂盒说明书测定血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性;取血后颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出肝脏称重(计算肝指数=肝重/体质量×100%)，左叶用冷生理盐水制备成100g/L肝匀浆，测定肝匀浆上清液SOD活力及MDA含量，取肝组织匀浆用考马斯亮兰蛋白测定法测定蛋白含量;取肝右叶用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，进行HE染色，观察其病理变化。

1.2.3 统计学处理。实验数据用计算机instate件处理，所有数据以均数加减标准差()表示，采用χ2分析方法，P＜0.05表明有显著性差异。

2 结果

2.1 小鼠一般状态 除正常对照组外，各组小鼠自灌胃乙醇第3天出现易激惹、反抗性增强或减弱、聚堆，部分小鼠出现腹部胀大，进食及饮水量减少，毛色无润泽，稍竖立，随着灌胃时间的延长上述现象加重。与模型组比较，不同剂量白藜芦醇给药组小鼠一般状态有改善，高剂量组更明显。

2.2 白藜芦醇对小鼠体重、肝指数的影响 见表1。由表1可以看出灌胃乙醇可使小鼠体质量和肝指数降低，与模型组比较，白藜芦醇各给药组体质量和肝指数有所增加，且有剂量依赖性。

表1 白藜芦醇对小鼠体质量、肝指数的影响(±s，n=12)

表1 白藜芦醇对小鼠体质量、肝指数的影响(±s，n=12)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05

肝重指数正常组组 别 体质量(g)灌胃前 灌胃后25.1±1.3 27.4±1.5 47.8±3.2模型组 24.7±1.4 20.1±1.2＊＊ 43.2±5.1＊＊白藜芦醇-低 24.6±2.0 20.7±1.7＊＊ 44.0±5.6*白藜芦醇-中 25.0±2.1 21.4±2.3＊＊ 44.6±4.9*白藜芦醇-高 24.8±1.7 22.3±1.9＊＊△ 45.6±4.7＊△

2.3 白藜芦醇对小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响见表2。表2结果显示，模型组小鼠血清ALT和AST明显高于正常组，高白藜芦醇各剂量组血清ALT活力和AST活力显著低于模型组(P＜0.05，P＜0.01)，高剂量组作用更明显。

表2 白藜芦醇对小鼠血清ALT和AST的影响(±s，n=12)

表2 白藜芦醇对小鼠血清ALT和AST的影响(±s，n=12)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01

组 别 剂量(g/kg) ALT(U/mL) AST(U/mL)28.33±6.83 80.00 ±8.31模型组 65.17±6.02＊＊ 226.67±12.40＊＊白藜芦醇-低 0.02 59.55±5.27＊＊△ 198.34±13.31＊＊△白藜芦醇-中 0.04 51.23±4.32＊＊△△ 175.64±12.27＊＊△白藜芦醇-高 0.08 44.16±4.56＊△△ 151.36±11.14正常组＊＊△△

表3 白藜芦醇对小鼠肝组织MDA、SOD的影响(±s，n=12)

表3 白藜芦醇对小鼠肝组织MDA、SOD的影响(±s，n=12)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01

MDA SOD正常组组 别 剂量(g/kg)11.52±1.81 14.22±3.1模型组 18.54±2.52＊＊ 7.68±2.14＊＊白藜芦醇-低 0.02 17.04±2.17＊＊ 8.56±2.62白藜芦醇-中 0.04 15.87±2.74＊＊△ 10.97±2.41＊＊△白藜芦醇-高 0.08 14.13±2.63＊△△ 11.41±2.53＊△△

2.4 白藜芦醇对小鼠肝组织MDA、SOD的影响 见表3。由表3可见，模型组高肝组织SOD的活性明显降低，而MDA含量明显升高;与模型组比较，白藜芦醇可以显著提高肝组织SOD的活性和降低MDA的含量，呈明显剂量效应关系。

2.5 白藜芦醇对小鼠肝组织外观及病理改变的影响 正常对照组肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性;模型组则肝脏表面呈黄褐色，有些呈灰白色，弹性差;白藜芦醇各给药组多数外观介于对照组与模型组之间。HE染色光镜下见:正常组肝小叶结构清晰，肝细胞索排列规则，以中央静脉为中心，呈放射状排列，肝细胞未见异常改变;模型组小鼠肝细胞索排列紊乱，细胞可见大小不等、分布不均的脂滴，有空泡样病变，部分肝细胞溶解坏死或细胞核溶解，大量炎细胞浸润;白藜芦醇各给药组肝组织病理改变有所减轻，部分肝细胞出现水肿与脂肪变性，可见点状坏死，高剂量组有少数肝细胞水肿，轻度脂肪变性及坏死。

3 讨论

肝脏是酒精的代谢器官，肝细胞对酒精及其衍生物乙醛的影响极为敏感，过量饮酒可造成肝脏不同程度的损伤。据统计，重度饮酒精者中90% ～100%有一定程度的脂肪肝，10% ～35%可发展成酒精性肝炎，8% ～20%将发展为肝硬化［7］。

酒精在肝细胞内会产生过多的氧应激产物，如OH-、O2-，H2O2等自由基。这些自由基可激活磷脂酶及脂质过氧化反应，降低膜磷脂，改变其通透性和流动性，从而改变与膜结合的酶、受体和离子通道的微环境，影响其功能。因此，血清转氨酶活性升高是肝细胞受损的敏感性指标［8］。实验结果显示，模型组小鼠血清ALT、AST活性与正常对照组相比明显升高，白藜芦醇可呈剂量依赖性明显降低血清ALT、AST活性，说明白藜芦醇对乙醇诱导的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

MDA作为过氧化脂质代谢产物，是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。MDA可与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，最终导致细胞无法维持正常代谢而死亡［9］。本实验的结果表明，与模型组比较，白藜芦醇各剂量组血清与肝脏组织中MDA含量均明显减少，而且高剂量白藜芦醇组效果更佳，说明白藜芦醇可使酒精所致急性肝损伤模型小鼠的MDA含量升高。并呈明显量效关系。

SOD是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，酒精的摄入使其活性减弱，引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，形成脂褐质以及使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏，从而加速肝脏损伤［10］。本实验结果表明，与模型组比较，白藜芦醇各剂量组小鼠血清与肝脏组织中SOD活性均明显增强。由此可推断白藜芦醇可以抑制酒精所致急性肝损伤模型小鼠SOD活性的降低，并呈明显量效关系。产生上述实验结果可能是由于白藜芦醇能清楚氧自由基，减轻炎性反应，抗脂质过氧化损伤，从而起到了保护酒精性肝损伤的作用。

［1］庄 辉.酒精性肝病的流行病学［J］.中华肝脏病杂志，2003，11(11):698

［2］Joseph AB，avid AS.Therapeutic potential of resveratrol:in vivo evience［J］.Drug Discovery，2006，5(6):93

［3］BAUR J A，SINCLAIR D A.Therapeutic potential of esveratrol:in vivo evience［J］.Nat Rev Drug Discovery，2006，5(6):493

［4］余慧琳.藜芦醇的生理功能及其应用前景［J］.物学通报，2005，40(11):12

［5］莫志贤，邵红霞.白藜芦醇苷体外对过氧化氢导致小鼠肝细胞损伤的保护作用［J］.中国药学，2000，16(5):519

［6］钟 芳，罗少军，少 明.白藜芦醇抑制细胞增值研究新进展［J］.中草药，2003，34(5):2

［7］Mann RE，Smart RG，Govoni R.The epidemiology of alcoholic liver disease［J］.Alcohol Res Health，2003，27(3):209

［8］Kew MC.Serumam inotrasferase concentration as evidence of hepatocellular damage［J］.Lancet，2000，355(9204):591

［9］朱平生，宇 亮，彭 成，等.橄榄解滔饮对急性酒精性肝损伤大鼠细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响［J］.上海中医药杂志，2006，40(6):21

［10］Char，TY.Oxidative DNA damage，antioxidants and cancer［J］.J Pineal Rea，1996，20(2):187