药用植物琉璃苣根尖压片技术研究

周慧媛 张红梅 李思颖 蔡宝宏 杨文平

(河北联合大学生命科学学院 河北唐山 063000;①唐山市第一中学)

琉璃苣(Borago officinalis L.)是紫草科一年生草本植物，原产于小亚细亚和地中海沿岸。该植物稍具黄瓜香味，全身披满白色绒毛，叶大，绿色椭圆形，叶缘有细齿，花蓝色或蓝紫色。果为小坚果，长5mm，具棱。此外，琉璃苣是欧洲人使用了700年的药草，拥有许多医学价值。植物染色体的研究对物种的变异、进化、遗传以及生活力过程平衡的控制都具有重要的作用。目前尚未有琉璃苣根尖压片技术、染色体数目、核型分析等细胞水平的相关报道。本研究以琉璃苣根尖为材料，探讨根尖压片法制备琉璃苣染色体的最佳条件，为琉璃苣细胞学特征、遗传机制、染色体核型分析的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 琉璃苣种子购于兴华专业花卉种子公司，经学院教研室的李超老师鉴定。

1.2 方法

1.2.1 取材。大解剖盘中平铺1cm左右的松针土，其上再撒上一层琉璃苣种子，而后种子上覆盖一薄层松针土。定时浇水，保持湿度，室温下培养萌发。培养1周后，选取长约1cm左右的根尖，取材时一般取包括根毛区在内的整个根尖。从上午8:00～16:00每隔半小时剪取根尖1次，每次约剪根尖20个左右。

1.2.2 预处理。剪好的根尖分别于0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%秋水仙素中预处理。每种浓度分1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h几个时间段，以其确定预处理的最佳条件。

1.2.3 固定。经预处理后的材料用蒸馏水冲洗干净，放入卡诺固定液(3甲醇:1冰醋酸)中固定2～4h。

1.2.4 解离。解离液为0.1mol/L的HCl。用蒸馏水将固定后的材料冲洗干净，放入解离液中解离。分别在室温和60℃下将材料分 5、8、10、12、15、17、20min7 个时间段解离，最后根据观察结果确定最佳解离条件。

1.2.5 低渗。解离后的细胞放入蒸馏水中停留5min以上，一般不超过2h，使细胞充分吸水膨胀，便于染色体分散。

1.2.6 染色和压片。配制改良石炭酸品红染色液［1］，放置2周后使用。经低渗的材料放置于载玻片上，用手术刀切取每个根尖呈乳白色的分生区部分(此区较膨大)1mm左右，在根尖材料上滴一滴染色液进行染色，10min即可。染色后的材料按常规方法压片，制成临时装片。

1.2.7 镜检和封片。显微镜下选择分散好的染色体中期分裂相计数。在有良好分散相的装片上滴1滴二甲苯，用手术刀片将盖玻片揭开，使有细胞的一面向上置于载玻片空白处，在37℃烘箱中烘24h以上，用加拿大树胶封片，选取分散良好的中期细胞进行显微摄影。

2 结果与分析

2.1 取材时间 通过分不同的时间段取材，观察不同取材时间对染色体压片技术的影响。根据视野中所观察到的中期细胞的多少，来确定最佳的取材时间。最佳取材时间为上午8:00～9:00，此时处于中期的琉璃苣细胞较多，见图1、图2。

图1 处于分裂中期的琉璃苣细胞图

图2 琉璃苣体细胞分裂中期染色体图

2.2 秋水仙素浓度和处理时间 秋水仙素预处理是制备染色体成功的关键步骤，实验中最终确定预处理的最佳条件为0.1%秋水仙素预处理2.5～3h。不同浓度的秋水仙素和不同的处理时间，对染色体制备有一定的影响。秋水仙素浓度过大、处理时间过长，导致染色体凝集成颗粒状或团块状，无法进行染色体类型鉴定。反之，秋水仙素浓度过低或处理时间过短，获得的中期细胞较少。因此，在制备植物染色体压片时，一定要根据不同的植物材料，选择合适的预处理液浓度和预处理时间，以其制备更佳的染色体标本。

2.3 解离时间 不同的解离时间，影响细胞膜的破裂情况。解离时间过长，容易造成染色体丢失;解离时间过短，细胞壁不易破碎，细胞呈方形，没有膨胀，无法得到分散的染色体。结果表明0.1mol/L HCl 60℃水浴5min，效果较好。

总之，影响根尖压片技术的因素很多，植物材料的生理状态、预处理液的浓度、处理时间、解离条件、染色条件等。实验中以1cm左右的琉璃苣根尖为试材，上午8:00～9:00剪取，经0.1%的秋水仙素预处理2.5～3 h，0.1mol/L HCl 60℃水浴解离5min，改良石炭酸品红溶液染色10min，对琉璃苣根尖进行常规染色体压片，即可制备出分散良好的琉璃苣染色体标本(图2)，为琉璃苣的细胞学特征、遗传机制、染色体核型分析的研究提供理论依据。经过对30个染色体分散较好的中期细胞的分析，初步确定琉璃苣细胞的染色体数目为2n=18。

预处理可以积累大量处于分裂中期的染色体，还可以诱导染色体进一步凝集，便于染色体分散。不经预处理的材料，由于分裂指数偏低，不适宜进行染色体计数。但要确定最佳的预处理时间以及预处理液浓度。一般的材料选用秋水仙素进行预处理即可。

［1］杨大翔.遗传学实验［M］.北京:科学出版社，2004.157?