CO2气腹环境对人宫颈癌Hela细胞生长及卡铂敏感性的影响

艾 君 韩 萍李 楠

(河北联合大学附属医院妇产科 河北唐山 063000)

随着微创手术技术的发展，腹腔镜在妇科良性肿瘤手术中的应用日益增多。但腹腔镜用于恶性肿瘤手术的安全性，特别是术后发生肿瘤腹腔扩散和穿刺点转移的问题引起很大的争议［1］，主要焦点是CO2气腹是否促进肿瘤生长与种植转移以及腹腔镜术后化疗药物敏感性问题。Hela细胞是宫颈癌中典型的癌细胞，增殖异常迅速，常被用作实验室研究的对象。本实验选取人宫颈癌Hela细胞为研究对象，采用CCK8法检测细胞增殖抑制率，流式细胞仪PI染色分析细胞周期;Annexin V-FITC检测细胞早期凋亡率，探讨体外模拟腹腔镜CO2气腹环境对人宫颈癌Hela细胞生长，及经过CO2环境作用后人宫颈癌Hela细胞对化疗药物卡铂敏感性的影响，以评价CO2气腹腹腔镜手术在宫颈恶性肿瘤手术中应用的安全性，并为腹腔镜术后早期使用化疗药物的可靠性、必要性和有效性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂和仪器DMED培养基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，卡铂(大连美仑生物技术公司)，青霉素为华北制药集团公司产品;链霉素为山东鲁抗医药股份有限公司产品;乙醇(上海国药集团)，Annexin V/PI检测试剂盒(BD公司)，CCK-8试剂盒(碧云天公司)，CO2培养箱(Thermo公司)，CO2气腹机(日本OLYMPUS公司)流式细胞仪(FACSCalibur BD公司)，细胞过滤器(Millipore公司)，酶标仪MK3(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。人宫颈癌Hela细胞株购自上海中科院，细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中置于37℃，5%CO2培养箱中常规传代培养。实验所用细胞均系传2～3代后的对数生长期细胞。

1.2.2 实验分组及处理。共分为4组，①对照组:细胞置于细胞培养箱中继续常规培养72h;②CO2组:细胞置于3L无菌引流袋内，密闭后用无菌引流管与腹腔镜气腹机连接，将气腹机压力调至12mmHg通入99.5%医用 CO2，流速2.5L/min，将无菌引流袋连同其内的细胞培养基一起放入37℃细胞培养箱内，持续作用2h后，从引流袋内取出培养瓶，置于细胞培养箱内继续常规培养72h;③卡铂组:细胞置于细胞培养箱中培养24h后换用含20μg/mL卡铂培养液继续培养48h;④CO2+卡铂组:细胞在经过上述CO2处理后常规培养24h，再换用含20μg/mL卡铂的培养液，置于细胞培养箱内继续培养48h。

1.2.3 细胞增殖抑制率检测。采用Cell Cownting Kit-8(CCK-8)法。取对数生长期的Hela细胞，以1×106/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL。每组设3个平行复孔。按上述要求进行实验分组及细胞处理后，每孔加入10μLCCK-8液37℃细胞孵箱继续培养4小时后，采用全自动酶联免疫检测仪在450nm波长测定各孔吸光度值，分别计算各实验组的增殖抑制率。抑制率=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

1.2.4 流式细胞技术(PI染色法)检测细胞周期。取对数生长期的Hela细胞以1×106/mL的密度接种于6孔培养板中。按上述细胞处理方法完成细胞处理;0.25%胰酶消化收集细胞，PBS液洗2次，1000r/min离心5min，弃上清，调整细胞浓度为1×106/mL，遇冷70%的冰乙醇固定细胞，并吹打成单细胞悬液，4℃过夜。2000r/min离心10min，用 PBS洗涤细胞2次，加入10μL RnaseA(1mg/mL)，加入 50μL PI染液(50μg/mL)，4℃避光30min，用300目尼龙网过滤样品后上机检测。实验重复3遍。

1.2.5 流式细胞技术(Annexin V-FITC分析)检测细胞早期凋亡率。按上述同法收集各组Hela细胞，每组计数1×106/mL，离心，弃上清，用冷PBS洗2次，按照流式试剂盒的说明染色，随即用BD FACSCalibur流式细胞仪检测，用波长为530nm的通带滤器检测FITC荧光。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验数据用()表示，组间多重比较采用LSD检验，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组细胞增殖抑制情况本实验结果显示:CO2处理组的人宫颈癌Hela细胞增殖抑制率明显降低，卡铂组与CO2+卡铂组比较细胞的增殖抑制率无明显差异。CO2组与CO2+卡铂组比较，肿瘤细胞的增殖抑制率明显增加，具体见图1。

图1 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组细胞增殖情况

2.2 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组细胞周期变化 本实验结果显示CO2处理组与对照组比较细胞周期无明显改变;卡铂组与CO2+卡铂组比较，细胞周期改变无明显差异;与对照组相比，卡铂处理组细胞周期有规律性改变，见表1。卡铂处理组可见G1、G2期细胞明显减少，S期细胞显著增多，见表1。

表1 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组的细胞周期分布

2.3 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组细胞凋亡情况 本实验CO2组与对照组比较细胞凋亡率明显下降，卡铂组与CO2+卡铂组比较细胞凋亡率未见明显增加，CO2组与CO2+卡铂组比较，后者细胞凋亡率明显增加。具体见表2。

表2 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组的细胞凋亡率(±s)

表2 人宫颈癌Hela细胞各实验组和对照组的细胞凋亡率(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;CO2组与CO2+卡铂组比较，#P＜0.05

组别 早期凋亡率(%)CO2组 1.13±0.07*1.51±0.11卡铂组 2.47±0.67*CO2+卡铂组 2.40±0.67*#对照组

3 讨论

随着科学技术的迅猛发展，腹腔镜手术临床应用日益广泛，恶性肿瘤行腹腔镜手术在技术上是可行的，有报道认为腹腔镜术后穿刺孔肿瘤转移明显高于开腹手术，可能与过去腹腔镜技术不完善有关，随着腹腔镜技术的提高，最近报道腹腔镜术后穿刺孔肿瘤转移发生率低于1%，与开腹手术无明显差异［2］。随着手术条件的成熟和设备的更新，技术上的难题已得到解决，现在争议的焦点集中在腹腔镜CO2气腹环境是否会促进癌细胞的播散及种植转移［3］。国内外大量研究证实CO2气腹能促进术后PSM和肿瘤增殖［4，5］，严重影响患者术后生活质量和5年存活率。也有学者持相反观点:Leng J.等［6］将人卵巢癌细胞株(SKOV3和HO8910)在模拟CO2气腹环境下进行体外培养，分别给予不同的压力及作用时间，发现HO8910细胞生长速度与CO2压力和作用时间呈反比，而SKOV3细胞株的生长也有着类似变化，并以细胞的G1期最为明显。CO2能否促进宫颈癌细胞生长的问题也有待深入研究。

由于手术或者放疗属局部治疗，单纯手术和放疗就无法解决肿瘤的扩散与转移，因此，可将化疗应用于放疗和手术前后，以增加综合治疗效果。当前治疗宫颈癌的一线药物中首选铂类，其敏感性直接关系到治疗效果和5年存活率。铂类为细胞周期非特异性抗癌药，主要是通过选择性的攻击增殖细胞DNA碱基的氮原子，由于铂类和DNA呈交叉联接，对DNA的构型有明显影响，双螺旋解旋使分子变短;可与DNA形成链内交联，也可形成链间交联或DNA-蛋白质间的交叉联结。本实验中所使用的卡铂(CBP)是第二代铂类药，与顺铂相比，由于消化道反应轻、肾及神经毒性小、抗瘤谱广，目前在临床使用广泛。

在腹腔镜手术中，使用的气腹压力一般是12mmHg，平均气腹持续时间为2h左右，因此要研究体外模拟CO2气腹环境对人宫颈癌细胞Hela细胞生长的影响，首先要建立可靠的体外模拟CO2气腹环境模型，并保证体外模拟CO2气腹环境的压力能维持在12mmHg持续2h。笔者利用无菌的医用3L袋和全自动气腹机成功建立了体外模拟CO2气腹环境，该方法简单易行，可操控性强，能准确控制实验所需的体外模拟CO2气腹压力和时间。

本实验中我们首先采用MTT比色法检测各组细胞增殖抑制率;还通过流式细胞仪将处于各细胞周期的细胞分选，我们还通过流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率，用以研究体外模拟CO2气腹环境对人宫颈癌Hela细胞增殖及卡铂敏感性的影响。实验结果表明:①CO2处理组的人宫颈癌Hela细胞增殖抑制率及早期凋亡率均明显降低，细胞周期与对照组相比无明显差异，表明CO2环境能促进人宫颈癌Hela细胞生长与增殖。其机制可能为:CO2通过使细胞外液压力增加，导致细胞膜内外压力差变大，影响细胞膜的正常生理状态来实现的;也可能为CO2气体本身作为一个独立因素对细胞的生长有促进作用;还可能为CO2气腹通过上调细胞抗凋亡基因或者凋亡抑制基因表达，促进宫颈癌细胞增殖［7～9］。提示在临床中应慎重使用腹腔镜行宫颈恶性肿瘤手术。②卡铂组、CO2+卡铂组与对照组比较，肿瘤细胞的增殖抑制率及早期凋亡率均明显增加，其机制可能为卡铂抑制细胞周期的有序进行密切相关，卡铂直接作用于DNA，主要与细胞DNA的链间及链内交链使DNA受损，DNA受损信号可以通过促分裂原活化蛋白激酶、p53和p73等多种信号转导通路，介导凋亡信号的激活，最终引起细胞凋亡或细胞周期抑制［10］;卡铂组、CO2+卡铂组与对照组比较，还可见卡铂处理组G1、G2期细胞明显减少，S期细胞显著增多。其机制可能为:卡铂使人宫颈癌Hela细胞阻滞于S期，S期阻滞为细胞提供充足的时间使受损DNA得到修复，当DNA损伤超过细胞的修复或耐受极限时，S期关卡功能就会减弱，细胞不能得到有效修复，最终导致死亡。③CO2组与CO2+卡铂组比较，细胞的增殖抑制率有显著差异;卡铂组与CO2+卡铂组比较细胞的增殖抑制率无显著差异，表明气体处理后卡铂对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制率无交互作用，卡铂抵消了CO2的不利作用。表明模拟腹腔镜CO2气腹环境作用后人宫颈癌Hela细胞对卡铂敏感性无明显改变，提示临床工作中，可以在腹腔镜手术中早期应用化疗药物，预防腹腔镜术后肿瘤细胞腹腔及穿刺口增殖转移，但是药物剂量尚需进行大量的动物实验及临床实验来确定。

肿瘤的发生发展过程复杂，其具体机制至今未明。本实验体外模拟CO2气腹环境，探讨CO2对人宫颈癌Hela细胞生长的影响及CO2环境作用后对卡铂敏感性的变化。但本研究仅仅是在细胞水平完成的实验，在体内能否可以达到相似的效果还有待进一步进行大量的动物实验及临床研究，最终为CO2气腹腹腔镜手术用于宫颈恶性肿瘤手术的安全性，以及腹腔镜术后早期使用卡铂行辅助化疗的有效性、必要性及安全性提供更明确的依据。

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