脂肪间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺疾病的实验研究

黄志昂 尚 艳 刘方方 赛亚飞 路武杰 冯志军

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以气流受限为主要特征的慢性呼吸系统疾病，其病情常呈进行性进展，患病率及病死率较高，严重危害患者身体健康，已成为一个重要的公共卫生问题［1］。COPD主要累及肺脏，病因较为复杂，炎症反应被认为是其主要发病机制，但目前尚未找到有效治疗方案［2］。干细胞是一类能特异性分化成各种组织器官的细胞，目前临床上以被应用于多种疾病的治疗中，其中脂肪间充质干细胞（amniotic-derivedmesenchymalstem cells，ADMSCs）因具有强大自我更新能力及分化潜能，业已成为再生医学及组织工程学应用较多的理想种子细胞［3］。研究证明，干细胞移植对多种肺损伤均有较好的修复作用［4，5］，但 ADMSCs治疗肺疾病方面的研究较少。本研究采用熏香烟加气管注入内毒素诱导的COPD大鼠模型为实验对象，将培养ADMSCs移植到模型鼠肺脏组织内，观察外源性的ADMSCs对模型鼠肺脏组织的病理和生化指标的影响，藉以探究 ADMSCs在COPD治疗中的价值，为临床治疗COPD另辟思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1COPD模型的制备与分组 取健康SPF级雄性SD大鼠60只，体重（220±20）g（由上海斯莱克实验动物有限公司提供），将其随机分对照组、治疗组及模型组，治疗组和模型组大鼠进行COPD模型的制备，对照组不进行造模。取40只SPF大鼠，给予生理盐水 10 ml/（kg·d）灌胃 4周后开始建模，于建模第 1、14 d经气管注入2 g/2l内毒素（Sigma）200μl，第2～30 d（第14 d除外）将大鼠置入有机玻璃仓内，注入过滤嘴香烟烟雾，0.5 h/d，每天以生理盐水灌胃，以大鼠出现频繁咳嗽症状作为判断造模成功的标准。

1.2ADMSCs的分离、培养 另取健康SPF级雄性SD大鼠2只，颈椎脱臼法处死，分离附睾及腹股沟处脂肪组织，PBS冲洗后剪碎，取少量置于离心管内，加入胶原酶混匀，于37℃消化2 h，加入低糖DMEM培养基，混匀后离心10 min，弃上清液，PBS冲洗2遍，加入完全培养基，混匀后吸取少量悬浮液接种于培养基中，37℃培养；体积分数5%时转入CO2培养箱培养，培养至细胞达80%～90%融合时，加入胰酶消化，按1∶2比例传代培养；于第3代细胞融合达80%时加入含溴氮胞苷（BrdU），37℃孵育30 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观察细胞标记情况，消化细胞传代培养。使用免疫组化技术、细胞表面特异性标志物鉴定体外培养的ADMSCs及诱导分化的细胞。

1.3ADMSCs的移植 造模成功后1周，对照组及模型组大鼠经尾静脉注射0.5 ml生理盐水，治疗组大鼠尾静脉注射0.5 ml BrdU标记的ADMSCs悬液。

1.4观察指标

1.4.1 肺功能 用小动物肺功能测定仪测定各组大鼠1 s时间用力呼出量（FEV1）及其与用力肺活量之比（FEV1/FVC）、最大呼气中期流速（MMEF）、最大呼气流量（PEF）等。

1.4.2炎症因子水平测定 细胞移植后14 d时，打开大鼠胸腔，使气管及双肺暴露，切开气管，血管钳夹闭右侧主支气管支，左肺注入生理盐水进行灌洗，停留数秒后抽出灌洗液，离心弃去上清液备用。吸取灌洗液滴入细胞计数板，低倍镜视野下计数；另取少量细胞涂片及瑞氏染色，选取细胞计数板上的白细胞，根据细胞形态分类计数，计算各种白细胞百分率。采用酶联免疫吸附法测定灌洗液中白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、及C反应蛋白（CRP）水平。试剂盒由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，实验操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4.3病理变化 取大鼠右肺，多聚甲醛固定、石蜡包埋切片，常规HE染色，光学显微镜下观察。每例选择3张切片，随机选取5个视野，避开支气管及大、中型血管，观测下列指标：

1）肺泡间隔数（MLI）：以每个视野正中为中心作“+”字交叉线，计数经此“+”字线的肺泡间隔数，测定+字线长度；肺平均内衬间隔（MLI）=肺泡间隔数/“+”字线长度。

2）单位面积肺泡数（MAN）：视野里的肺泡数除以视野的面积。

3）平均肺泡面积（MAA）：MAA=（每个视野的面积-HE染色阳性区域面积）/肺泡数。

1.5统计学分析 所有数据采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ADMSCs培养结果 ADMSCs原代培养后可见贴壁细胞，培养6 d后细胞呈梭形；3代培养后形态均一，呈长梭形，细胞见可见脂滴存在（见封三图1）。

2.2各组肺功能指标的比较 与对照组比较，模型组和治疗组肺功能指标均显著下降（P＜0.05），而治疗组肺功能优于模型组（P＜0.05）。见表1。

2.3各组白细胞及免疫相关指标的比较 模型组和治疗组肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数及IL-8、TNF-α、CRP水平均显著高于对照组（P＜0.05），治疗组各免疫细胞数及免疫相关指标水平均显著低于模型组（P＜0.05）。见表2、3。

2.4各组肺组织病理变化 模型组、治疗组肺组织切片均可见COPD病理性变化，治疗组较模型组肺气肿病理改变轻（见封三图2）。各组肺组织MLI、MAN、MAA比较差异具统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表1 各组肺功能指标的比较x±s

表1 各组肺功能指标的比较x±s

与对照组相比，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 n FEV1（L） FEV1/FVC（%） MMEF（L/s） PEF（L/s ）对照组20 2.18±0.22 82.89±3.25 1.88±0.21 4.92±0.13模型组 20 0.98±0.15* 40.66±4.26* 0.89±0.22* 3.98±0.21*治疗组 20 1.67±0.25*# 69.09±2.99*# 1.42±0.19*# 4.44±0.11*#

表2 各组白细胞及其相关分类的比较±s

表2 各组白细胞及其相关分类的比较±s

组别 n 白细胞（×109/L） 巨噬细胞（%） 中性粒细胞（%）对照组20 2.36±0.47 1.58±0.29 6.99±1.26模型组 20 6.27±1.01* 3.26±0.45* 26.79±1.69*治疗组 20 3.98±0.28*# 2.27±0.29*# 14.37±1.35*#

表3 各组免疫相关指标的比较±s

表3 各组免疫相关指标的比较±s

与对照组相比，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 n IL-8（ng/L） TNF-α（g/L） CRP（ng/L）对照组20 24.37±2.49 20.38±3.56 2.38±0.39模型组 20 55.89±3.27* 69.39±4.22* 20.31±4.28*治疗组 20 33.38±2.33*# 34.70±3.61*# 8.92±1.33*#

表4 各组肺组织病理指标的比较±s

表4 各组肺组织病理指标的比较±s

与对照组相比，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 n MLI（μm） MAN（106/m2） MAA（μm2）对照组20 58.38±8.22 398.45±20.48 4980.33±389.48模型组 20 88.39±9.01* 201.33±23.82* 8189.24±478.56*治疗组 20 66.07±3.57*# 325.39±24.28*# 5827.33±390.45*#

3 讨论

研究认为，COPD的发病机制主要以炎症的级联反应为主要特征，炎症细胞的聚集、活性氧及蛋白水解酶类释放，以及蛋白酶的水解和氧化损伤的发生，导致不可逆的上皮细胞凋亡及小气道壁受损、肺泡腔扩大，最终导致COPD的发生。目前COPD主要以消除炎症、扩张支气管等缓解症状的治疗，尚无有效逆转肺损伤的治疗方式。因此，寻找修复肺部组织结构的有效方法是从根本上治疗COPD的关键措施。

间充质干细胞是具有一定更新能力及多向分化潜能的成体干细胞，在适宜情况下可向多种中胚层及神经外胚层来源的组织细胞分化。目前临床上骨髓间充质干细胞应用较广。近年来研究表明，脂肪组织中同样具有大量间充质干细胞，具有体外增值及多重分化的潜能，可用于组织和器官的再生与修复。相较于其他间充质干细胞，ADMSCs的取材较为简单，脂肪中的间充质干细胞含量丰富，且ADMSCs免疫源性较低，可减少移植的排斥反应，临床引用价值较大。研究认为，脊髓间充质干细胞在体内、外可分化为肺上皮细胞，促进肺组织的再生。另外，其还可分泌细胞因子及生长因子等多种生物活性物质，抑制肺组织的凋亡，改善组织损伤部位及微环境，为损伤的修复提供有利的环境，有利于COPD的治疗，但ADMSCs在COPD临床治疗研究报道尚少。

本研究采用熏香烟加气管注入内毒素方法诱导大鼠建立COPD模型后，比较对照组与模型组大鼠肺功能、炎症因子及病理切片情况，显示模型组肺功能显著低于对照组，其炎症因子水平均显著升高，病理切片示显著的肺水肿征象，提示本研究COPD建模情况较好，建模大鼠均出现COPD相关症状及病理诊断征象，也进一步提示炎症反应是COPD发生发展的重要因素之一。

为探究ADMSCs对COPD肺损伤的作用，比较采用ADMSCs移植治疗的大鼠和未行ADMSCs移植治疗大鼠的肺部功能及相关炎症指标，结果显示，治疗组肺功能显著优于模型组，且相关炎症因子水平均显著低于建模组，证实 ADMSCs可一定程度上改善COPD大鼠的肺功能，并降低炎症因子的表达。

研究表明，TNF-α可直接损伤毛细血管内皮细胞，聚集、黏附及激活中心粒细胞，使中性粒细胞产生大量的氧自由基，加速肺脏损伤，而IL-8等炎症因子均可对TNF-α起到重要的协同作用。本研究显示ADMSCs可明显降低相关炎症因子的表达，进而缓解COPD的相关症状。对各组肺部病理切片分析发现，治疗组较模型组肺气肿病理改变轻，提示ADMSCs可促进肺损伤的修复。研究表明，间充质干细胞可分泌多种细胞保护和修复作用的生长因子，可刺激血管生成、抑制纤维化及细胞凋亡。本研究结果提示，ADMSCs可能具有类似的作用，起到减轻肺组织细胞凋亡，促进肺受损部位修复的功效。吴林等［6］探究小鼠ADMSCs对减缓百草枯重度引起的肺损伤的作用效果，显示ADMSCs治疗组小鼠血浆中的TNF-α、IL-1β的含量显著低于未治疗组，且肺组织病理染色示ADMSCs治疗组肺组织纤维化程度显著低于未治疗组；常鹏宇等［7］也证实人脂肪来源间充质干细胞可抑制放射性肺纤维化进展，对肺组织有一定的保护作用。本研究进一步证实ADMSCs对COPD大鼠肺损伤也有一定的治疗作用。

综上，ADMSCs移植治疗可显著改善COPD大鼠肺组织的病理性改变，减轻炎症反应，改善肺功能，具有一定的治疗作用。