基于网络药理学分析痛泻要方治疗克罗恩病的作用机制

袁红昌，逯中民，陈 颖，朱 煜，杨明瑞，赵金金

(新乡医学院第一附属医院 1 药学部，2 检验科，新乡 453100)

克罗恩病是一种反复发作的肠道炎症疾病，病变部位多见于回肠末端和邻近结肠处，有时可累及整个消化道。临床表现为腹泻、腹痛、无肉眼血便或黏液血便，可出现腹部肿块、肛门病变及肠瘘等症状。中医认为克罗恩病属于“泄泻、痢疾、便血”等范畴，病理过程类似“肝郁脾虚、脾气受损”证候。痛泻要方源于《丹溪心法》[1]，由白芍、白术、陈皮、防风4味中药组成，是治疗肝旺脾虚痛泻的代表方剂。后世医家吴昆《医方考》卷二之泄泻门曰：“痛泻不止者，此方主之。”脾胃为后天之本，若因外感时邪、情志失调、饮食所伤，皆可损伤脾胃，脾胃虚弱，气血化源不足，导致肝阴血不足，肝用失制，肝气疏泄太过，肝旺乘脾，脾虚失运，升降失司，水湿不化，湿热蕴积肠胃而发病，故治疗应从柔肝祛风、健脾温中化湿[2]。痛泻要方常用于补脾抑肝，治疗肝郁脾虚腹泻[3]。痛泻要方的有效成分、作用途径、靶点多，作用机制尚未完全阐明[4]。目前网络药理学已应用于中药学研究，可直观地探索中药与机体之间的相互作用，从整体水平观察中药的疗效，为复杂的作用机制研究提供了新的方向和思路[5]。本研究采用网络药理学构建药物-疾病靶点网络探索痛泻要方的药理作用，以及治疗克罗恩病的作用机制。

1 方法

1.1 收集疾病靶点

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站检索克罗恩病的疾病基因，物种为“homo sapiens(human)”，查询“Crohn disease”和“Crohn’s disease”关键词，采用Pheatmap R包删除重复的疾病靶点。通过筛选阈值(P<0.05)得差异性基因，采用基因表达数据库(GEO)进行差异性基因分析，logFC>0和logFC<0分别为上调基因和下调基因，制作差异基因的火山图。

1.2 预测痛泻要方的活性成分及靶点

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)网站查询痛泻要方中白芍、白术、陈皮、防风4味中药的活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%以及药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18为条件筛选有效化合物。文献显示[6-7]，白术内酯Ⅰ(atractylenolide Ⅰ)和白术内酯Ⅲ(atractylenolide Ⅲ)为白术的主要活性成分，因此本研究纳入这2种成分。预测活性成分的作用靶点。

1.3 构建化合物-疾病靶点网络图

筛选痛泻要方的活性成分和克罗恩病靶点交集的靶点蛋白。利用Cytoscape 3.7.2软件包构建痛泻要方-克罗恩病靶点的网络图，节点为痛泻要方的活性成分和克罗恩病靶点；边为成分与靶点之间的作用关系。

1.4 构建PPI网络

利用Cytoscape 3.7.2软件BisoGenet包构建蛋白质相互作用(PPI)网络，PPI数据库来源于BIOGRID、HPRD、DIP、INTACT、MINT、BIND，物种为“homo sapiens(human)”。利用Cytoscape 3.7.2软件CytoNCA包对PPI网络进行拓扑分析，选取度中心性(degree centrality，DC)和介数中心性(betweenness centrality，BC)指标大于节点中位数的节点，分析其药理作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

采用ClusterProfiler R包对靶点进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以P<0.05(阈值)表示生物学功能有统计学差异，制作细胞组分(cell components，CC)、生物学过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)图。采用Cytoscape 3.7.2构建基因与KEGG之间的关系网络图，以P<0.05(阈值)表示有统计学差异。

2 结果

2.1 疾病靶点

经收集和筛选后，共得克罗恩病的靶点基因434个，上调基因和下调基因分别为249个和185个。见图1。

注：黑色为对照组和克罗恩病组无差异性基因；红色和绿色分别为克罗恩病组上调基因和下调基因图1 差异性基因的火山图

2.2 痛泻要方的成分及靶点

筛选痛泻要方的活性化合物28个(数据截至2020年5月23日)，包括山柰酚(kaempferol)、芍药苷(paeoniflorin)、儿茶素[(+)-catechin]等4个白芍成分；β-乙酰氧基苍术酮(β-acetoxyatractylone)、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ等5个白术成分；柚皮素(naringenin)、米橘素(citromitin)、川陈皮素(nobiletin)等4个陈皮成分；白花前胡乙素(anomalin)、欧前胡素(ammidin)、防风色酮醇(ledebouriellol)等16个防风成分；β-谷甾醇(β-sitosterol)为防风和白芍的共同成分。

2.3 化合物-疾病靶点网络图

28个化合物和15个疾病靶点构成了痛泻要方-克罗恩病疾病靶点的网络图，含节点43个和边71条。重要的疾病靶点为二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)、过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG)等；痛泻要方的主要化合物为白术内酯Ⅰ、山柰酚、

川陈皮素等。见图2和表1。

注：红色为疾病靶点；黄色、蓝色、灰色、紫色和青色分别为防风、白芍、陈皮、白术及共同成分图2 痛泻要方-克罗恩病靶点的网络图

2.4 PPI网络及靶点

经筛选DC和BC指标后得NOS2、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、微小染色体维持缺陷蛋白2(minichromosome maintenance 2，MCM2)等135个靶点蛋白。见图3和表2。

表2 痛泻要方-克罗恩病靶点的基本信息

(续表)

2.5 GO功能分析

BP富集较多的有对细菌源性分子反应(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、小分子代谢过程调节(regulation of small molecule metabolic process)、脂肪酸反应(response to fatty acid)等566个生物学过程；CC富集较多的有低密度脂蛋白粒子(low-density lipoprotein particle)、膜微结构域(membrane microdomain)、膜区域(membrane region)、内体膜(endosome membrane)等28个生物学过程；MF富集较多的有蛋白酶结合(protease binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、受体配体活动(receptor ligand activity)等7个生物学过程。

2.6 KEGG通路富集分析

结果显示，15个靶点在16条信号通路上富集有统计学差异(P<0.05)，主要通路为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信号通路、百日咳(pertussis)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)、核因子-κB(nuclear factor-кB，NF-κB)信号通路等。

2.7 KEGG与基因关系网络

结果显示，由10个基因和16条信号通路构成关系网络图，含26个节点和43条边；重要的基因为环加氧酶2(PTGS2)、趋化因子配体2(CCL2)及白细胞介素-1β(IL1β)等；重要的KEGG通路为百日咳、IL-17信号通路、利什曼病及类风湿关节炎等。见表3。

表3 痛泻要方-克罗恩病靶点的信号通路

3 讨论

克罗恩病的病因较多，与感染和免疫紊乱等因素有关。文献报道[8]，Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)是一种蛋白复合体，诱导IL-1β的分泌和成熟，与克罗恩病的发生高度相关。当结肠发生感染和黏膜损伤时，通过IL-1β激活刺激T细胞增殖引起黏膜免疫应答。克罗恩病患者肠组织中Th1细胞和Th17细胞数量增多促进白细胞介素-17A(interleukin，IL-17A)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等细胞因子分泌增多，表达上调，激活NF-κB炎症信号通路，诱导或加重炎症反应[9-10]。研究表明[11]，克罗恩病是由Th1/Th17介导的炎症反应，IL-17、IFN-γ、TNF-α等高表达引起效应T细胞与调节T细胞分化失衡。在克罗恩病发生过程中，TNF-α诱导IL-12促进Th1细胞分化和增殖[12]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)作为p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和NF-κB等传导信使激活细胞内的信号通路，影响细胞的增殖、分化及凋亡[13]。肠炎患者中 IL-1β 含量升高，但也有报道称IL-1β引发间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植，减轻结肠炎[14-15]。因此，IL-1β在黏膜免疫应答的作用仍未完全阐明。

痛泻要方由白术、白芍、陈皮、防风4味中药组成。中医认为，白术利水化湿、健脾燥湿；白芍益阴柔肝、缓急止痛；陈皮理气燥湿、醒脾健脾、化痰和胃；防风理气止痛、胜湿止泻，全方归肺经和大肠经，通过补脾抑肝、缓急止痛治疗克罗恩病[16]。研究表明[17]，白芍的主要成分有芍药苷和儿茶素。芍药苷具有抗炎、免疫调节、镇痛、抗抑郁等生物活性[18]；儿茶素具有抗病毒、抗炎、镇痛、解痉等作用。陈皮具有抗炎、抗氧化、调节免疫、抗癌等功效，用于治疗脘腹胀满、腹泻或便秘；陈皮的主要成分有柚皮素、川陈皮素、β-谷甾醇。柚皮素和川陈皮素具有抗氧化、减少氧自由基和抗炎作用[16,19]；β-谷甾醇可抗炎、调节免疫。防风具有抗炎、镇痛、抗菌等作用，可用于胃痛和胃肠炎治疗，疗效良好；防风的主要成分香豆素和色原酮具有抗病毒作用[20]。上述文献报道的关于白术、白芍、陈皮、防风4味中药的主要成分与TCMSP数据库筛选的化合物靶点基本一致，说明采用网络药理学方法预测痛泻要方主要靶点的准确性较高。

本研究通过IL-17、NF-κB、TNF等16条信号通路预测了芍药苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ、柚皮素、川陈皮素、β-谷甾醇等28个活性成分对克罗恩病的治疗作用。白术可降低IL-1β、TNF-α水平，减轻局部炎症反应[21]，通过调节toll样受体4(toll-like receptors 4，TLR4)/NF-κB信号转导，抑制后续致炎因子生成，恢复Th1/Th2失衡[21]。白术内酯Ⅰ抑制白细胞分化抗原14(lipopolysacharide 14，又称CD14)、TLR4、清道夫受体A类(scavenger receptor class A types，SR-A)的表达，减弱NF-κB活性，通过抑制TNF-α和IL-6产生抗炎作用[6]。白术内酯Ⅰ抑制NLRP3炎性体激活进而减少IL-1β[22]。白术内酯Ⅲ抑制NO、IL-6、TNF-α释放，抑制小鼠巨噬细胞的炎症反应。苍术酮通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子水平，抑制p65及NF-κB表达，减轻炎症反应[23-24]。芍药苷改善2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导的结肠炎TNF-α等因子的合成，促进IL-10合成，抑制p38 MAPK激活，抑制TNF-α分泌，减轻结肠的炎症[18]。山柰酚通过MAPK和NF-κB途径抑制ROS产生[25]，调节NF-κB信号通路，发挥抗炎和抗氧化作用。陈皮调节IL-17、NF-κB、TNF等信号通路，发挥抗炎、保护肝脏、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等作用[26]，还可调控低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路，影响NF-κB信号通路。

本研究应用网络药理学分析了痛泻要方治疗克罗恩病的作用机制，为研究中药复方效应机制提供一些新思路。但同时也存在不足之处，如痛泻要方的入血成分尚未完全明确，成分与疾病靶点的对接还有待进一步探索，以及缺少网络预测结果的临床和实验验证等，需进一步研究。