60Co-γ射线辐照灭菌对水蛭抗凝血酶活性的影响

王亚琼，钟水生，张华锋

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104)

药品的无菌检验和微生物限度是药品质量及监管中涉及安全性的重要检查指标。《中国药典》[1](2020年版)中新设立了中药提取物和中药饮片的微生物限度，新修订的《中华人民共和国药品管理法》[2](以下简称新版《药品管理法》)于2019年12月1日起施行。新版《药品管理法》加大了对生产销售伪劣药品的处罚力度，微生物检验不合格的药品属于劣药的范畴。目前中药常用灭菌方法以湿热灭菌和辐照灭菌为主，随着现代工业技术的发展，辐照已经实现了商业化的应用。由于辐照不会引起被辐照物的温度明显升高，对热敏性中药的杀菌有一定的优越性，同时由于大规格的样品灭菌非常便捷且成本低，使辐照灭菌的应用越来越普遍[3]。但有研究表明[3-11]，辐照灭菌对中药的有效成分并非毫无影响，超过5 kGy的辐照剂量会导致多个有效化学成分含量降低。水蛭作为《Co60辐照中药灭菌剂量标准》[12]中允许辐照的药材品种，尽管有研究表明辐照对日本医蛭提取物活性无影响[13]，但目前尚无针对辐照对水蛭药材活性影响的相关研究。本研究以水蛭抗凝血酶活性为指标，考察辐照对目前市场上常用的水蛭活性的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂

水蛭药材样品于2019年采购自亳州市药材市场零售摊位，详细信息见表1。纯水(美国Millpore公司)；12孔细胞板(美国Corning公司)；牛纤维蛋白原(批号140626-201611，规格凝固物含量44%)、凝血酶(中国食品药品检定研究院，批号140625-201712，规格1180单位/瓶)；0.9%氯化钠溶液(中国大冢制药有限公司)；三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液：0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液 25 ml 与0.1 mol/L盐酸溶液约40 ml，加水至100 ml，调节至pH 7.4；三羟甲基氨基甲烷、盐酸(国药集团化学试剂有限公司)。

表1 水蛭样品信息表

1.2 仪器

AG245电子天平(瑞士Mettler公司)；C-MAG恒温电热板(德国IKA公司)。

2 方法与结果

2.1 辐照条件

样品送苏州中核华东辐照有限公司进行钴60γ(60Co-γ)射线辐照，辐照剂量分别为5、10和20 kGy，辐照时间以辐照强度为准。

2.2 供试品的制备

取样品粉末约1.0 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5 ml，振荡提取30 min，静置后，3000 r/min离心5 min，精密量取上清液100 μl，置于12孔细胞板中测定(见图1)。

图1 12孔板抗凝血酶活性实验图

2.3 测定方法

样品孔加入含0.5%牛纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(临用配制)200 μl，摇匀，置恒温电热板上(37±1) ℃、5 min后，滴加每1 ml中含40单位的凝血酶溶液(滴加1次/min，每次5 μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固(用于活性较强的样品)或滴加每1 ml中含10单位的凝血酶溶液(滴加1次/4 min，每次2 μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固(用于活性较弱的样品)，记录消耗凝血酶溶液的体积，按公式计算：U=(C1V1/C2V2)。式中U为每1 g含凝血酶活性单位(U/g)；G为凝血酶溶液的浓度(μ/ml)；C2为供试品溶液的浓度(g/ml)；V1为消耗凝血酶溶液的体积(μl);V2为供试品溶液的加入量(μl)。中和一个单位的凝血酶量为一个抗凝血酶活性单位。

2.4 样品测定

选择活性较弱的药典收录品种宽体金线蛭(蚂蟥WhitmaniapigraWhitman)各3批次，活性较强的药典收录品种日本医蛭(水蛭HirudonipponicaWhitman)各2批次，活性较强的非药典收录品种光润金线蛭(Whitmanialaevis)各2批次及菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis)各3批次，测定其抗凝血酶活性。样品送辐照，分别接收5、10和20 kGy60Co-γ射线辐照后，再次测定样品中的抗凝血酶活性，测定结果见表2。

表2 辐照前后水蛭的抗凝血酶活性影响

2.5 数据分析

采用GraphPad Prism 6.0对所得数据进行分析，作图2和图3。组间统计学差异通过One-way ANOVA计算。P<0.05为具有统计学差异。

a:P<0.05图2 辐照前后水蛭抗凝血酶活性比较

a:P<0.05，b:P<0.01图3 高活性水蛭组辐照前后抗凝血酶活性比较

3 讨论

宽体金线蛭由于抗凝血酶活性弱，不同剂量辐照后抗凝血酶活性无统计学差异，但抗凝血酶活性较强的日本医蛭、光润金线蛭和菲牛蛭在高剂量辐照下活性降低(见图2和3)；当辐照剂量超过10 kGy，结果具有统计学差异。

本研究测定方法参考了《中国药典》(2020年版)水蛭项下抗凝血酶活性法[11]，实验中将试管改为12孔细胞板，水浴改为恒温热板，更便于观察实验结果及大批量样品的测试(见图1)。相比传统的试管法结果更易观察，方法更便捷。

根据以上实验结果可知，辐照会降低高活性水蛭组的抗凝血酶活性，建议对于具有生物活性的药材谨慎使用辐照灭菌的方法；如果需要辐照灭菌，建议辐照剂量不宜超过5 kGy。