EB病毒DNA拷贝量动态分析对晚期鼻咽癌患者化疗疗效的预测价值*

喜 燕，唐 亮，艾力根·阿不都热依木

新疆维吾尔自治区人民医院耳鼻喉诊疗中心，新疆乌鲁木齐 830001

鼻咽癌(NC)是目前我国常见的恶性肿瘤之一，国内外多个指南均指出EB病毒(EBV)在NC发生及发展过程中起关键性作用[1-2]。伴随着聚合酶链反应(PCR)技术的日渐成熟，目前EBV-DNA载量与NC疾病发展、治疗及预后之间的相关性研究较多，均指出其与NC患者上述疾病相关过程有密切关系[1-3]。目前，化疗是针对晚期NC患者具有一定效果的治疗手段，虽然既往有研究指出EBV-DNA表达水平与NC患者治疗疗效具有明显关系[4]，但是将其动态监测的具体值用于预测NC患者化疗预后的研究却相对较少，故开展本研究，旨在为准确评价晚期NC患者疗效提供实验室数据参考，进一步完善晚期NC患者的系统评价。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月至2020年1月于本院接受标准化疗方案的晚期NC患者131例作为研究对象。纳入标准：(1)所有患者均符合文献[5]中对于NC的诊断标准，且达到TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的标准；(2)依从性较好，均表示能接受完整的治疗周期；(3)年龄在18岁以上；(4)首次发现，之前未接受其他治疗方式；(5)首次EBV-DNA检测能测出EBV-DNA拷贝量。排除标准：(1)合并有其他类型的恶性肿瘤；(2)伴有严重全身性慢性疾病；(3)对治疗药物不耐受；(4)1个月内有免疫抑制剂使用史。所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1动态EBV-DNA监测方案 分别于治疗前后检测患者血浆中EBV-DNA拷贝量，而后分别计算其前后差值及前后比值。

1.2.2EBV-DNA检测方法 抽取患者清晨空腹静脉血3 mL，离心后取血浆并采用天根生化科技(北京)有限公司提供的血清/血浆游离DNA提取试剂盒对血浆中DNA进行提取，而后将提取后标本与探针[序列为：5′-(FAM)CCAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAAGG(TAMRA)-3′]及宝日医生物技术有限公司提供的Ex Taq酶混合后采用美国RocheBranch burg公司生产的LightCycler480荧光定量 PCR扩增仪进行扩增，扩增的目的基因来自EBV的BamH1-W片段，上、下游引物序列分别为F:5′-CCCAACACTCCACCACACC-3′；R:5′-TCTFAGGAG-CTGTCCGACCC-3′。反应过程为：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，93 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s，共40个循环，而后使用计算机对标准曲线及标本进行对比，计算反应体系中DNA拷贝量，单位为copy/mL，并取对数。

1.2.3化疗方案 所有患者均参照《耳鼻咽喉科疾病临床诊断与治疗方案》[6]中推荐的方式，采用文献[7]中提供的第1天多西他赛75 mg/m2，第1～3天顺铂25 mg/m2；或第1天多西他赛60～75 mg/m2，第1～5天氟尿嘧啶500～750 mg/m2，第1～3天顺铂20～25 mg/m2方案。上述方案均21 d为1个周期，化疗2～3个周期。根据患者具体情况有选择性地制订化疗方案。

1.2.4放疗方案 根据患者病情，部分需要增加放疗，选择调强方案为放疗方案，靶区勾画依据为国际辐射学单位委员会推荐的鼻咽癌放射治疗靶区[8]。处方剂量[9]：大体鼻咽肿瘤靶区为66.0～70.2 Gy，大体肿瘤淋巴结靶区为66.0～70.2 Gy，临床靶区为160～166 Gy，临床靶区2 为50～56 Gy，1次/天，每周5次，共30～33次。危及器官限量参照美国肿瘤放射治疗协作组相关规定[10]。

1.3观察指标及疗效评价标准

1.3.1观察指标 包括临床资料、实验室检查资料及影像学检查资料。(1)临床资料包括年龄、性别构成、体质量指数(BMI)、TNM分期、化疗方案及是否放疗等；(2)实验室检查资料包括血红蛋白(Hb)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)；(3)影像学检查资料包括最大病灶最大径、转移灶数目。

1.3.2疗效评价标准 患者完成全部治疗后评价标准参照实体肿瘤疗效评价标准1.1 版，有效例数=完全缓解(CR)例数+部分缓解(PR)例数。

1.4统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析处理。不符合正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Logistic分析疗效的影响因素；建立受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析EBV-DNA动态监测指标对NC患者化疗疗效的预测价值，曲线下面积(AUC)的比较采用Z检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组治疗前后EBV-DNA拷贝量及治疗前后拷贝量差值、比值比较 患者经过治疗后获得CR 21例，获得PR 74例，有效共95例，故最终分为有效组95例，男61例，女34例；无效组36例，男21例，女15例。Logistic单因素分析结果显示，有效组治疗前后EBV-DNA拷贝量均明显低于无效组，而治疗前后其拷贝量比值明显高于无效组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2两组患者的临床资料分析 有效组放疗例数占比明显高于无效组，而年龄明显低于无效组，差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表1 两组治疗前后EBV-DNA拷贝量及治疗前后拷贝量差值、比值比较[M(P25,P75)，lg(copy/mL)]

表2 两组患者的临床资料分析[M(P25,P75)/n(%)]

组别nTNM分期Ⅲ期Ⅳ期医保类型省/市医疗保险农村合作医疗保险商业保险无有效组9528(29.47)67(70.53)34(35.79)43(45.26)15(15.79)3(3.16)无效组3614(38.89)22(61.11)12(33.33)15(41.67)8(22.22)1(2.78)Z/χ21.0620.798P0.3020.849

组别n化疗方案TPTPF文化程度初中及以下中专/高中本科及以上有效组9551(53.68)44(46.32)18(18.95)64(67.37)13(13.68)无效组3617(47.22)19(52.78)9(25.00)21(58.33)6(16.67)Z/χ20.4360.952P0.5080.621

2.3两组患者的实验室检查资料及影像学检查资料分析 有效组LDH水平及最大病灶最大径均小于无效组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4影响疗效的Logistic回归分析结果 以疗效评价作为因变量，以单因素分析P<0.05的指标作为自变量(具体赋值见表4)进行Logistic回归分析，结果显示，治疗前EBV-DNA拷贝量(OR=1.789，95%CI：1.033～3.189)及LDH水平(OR=1.024，95%CI：1.011～1.039)是影响疗效的独立危险因素，而治疗前后EBV-DNA拷贝量比值(OR=0.775，95%CI：0.701～0.875)是影响疗效的独立保护因素(P<0.05)。见表5。

表3 两组患者的实验室检查资料及影像学检查资料分析[M(P25,P75)]

组别n实验室检查资料FIB(mg/dL)D-D(μg/L)影像学检查资料最大病灶最大径(cm)转移灶数目(个)有效组95372.14(343.84,402.55)235.21(204.97,264.96)3.15(1.86,4.11)2.18(1.29,2.69)无效组36391.34(360.89,406.42)250.59(213.96,282.97)3.72(2.85,4.77)2.38(1.67,3.17)Z1.4441.0782.0131.792P0.1490.2810.0440.094

表4 赋值表

2.5EBV-DNA动态监测结果对NC患者化疗疗效的预测价值 根据Logistic回归分析结果，将治疗前EBV-DNA拷贝量、治疗前后EBV-DNA拷贝量比值及LDH水平纳入对晚期NC患者化疗疗效的预测价值ROC曲线分析指标，结果显示，治疗前EBV-DNA拷贝量、治疗前后EBV-DNA拷贝量比值及LDH水平对NC患者化疗疗效的预测均有一定价值(P<0.05)，见表6、图1、表7；Z检验结果显示，治疗前后EBV-DNA拷贝量比值及LDH水平对NC患者化疗疗效的预测效果明显优于治疗前EBV-DNA拷贝量(Z=2.681、2.521，P=0.007、0.024)，但二者之间预测效果比较，差异无统计学意义(Z=0.313，P=0.754)。

表5 影响疗效的Logistic回归分析结果

表6 NC患者化疗疗效预测ROC曲线数据比较

图1 动态监测EBV-DNA对NC患者化疗疗效的预测价值

表7 动态监测EBV-DNA对NC患者化疗疗效的价值(%)

3 讨 论

化疗是针对晚期NC患者有效的治疗手段之一，在国内外多个指南中均推荐将此种方式联合放疗应用于晚期NC患者的治疗，均取得较好的疗效[11-12]。PRAYONGRAT等[13]研究指出，治疗前后不同时间点的EBV-DNA动态拷贝量与患者预后明显相关，说明EBV-DNA与NC患者治疗疗效可能存在一定的相关性。目前，对于NC患者疗效的判定依赖于PET-CT等影像学检查，其价格高昂，会导致患者经济负担加重，对于普通NC患者的后续治疗将产生不利影响[14-15]。

LDH是人体糖无氧酵解及糖异生的重要介质，其可以充当丙酮酸与L-乳酸之间的氧化还原反应关键酶，同时参与α-酮酸的合成及代谢[16]。LONG等[17]研究指出，LDH的亚型LDH-5可影响瘤体的浸润与转移。本研究指出，LDH水平升高会导致疗效明显下降，主要原因有以下几点：(1)LDH-5可以通过促进病灶内原癌基因激活的淋巴细胞向周围扩散，导致局部药物浓度下降，从而降低疗效[18]；(2)LDH-5还能促进癌灶内血管内皮生长因子的分泌，造成瘤体血流相对丰富，从而导致血型播散的可能性加大；(3)LDH与缺氧诱导因子的分泌有密切关系，虽然目前机制尚未完全被发现，但缺氧诱导因子与LDH水平呈正相关。YEH等[19]研究中缺氧诱导因子是导致恶性肿瘤患者产生药物抵抗的重要原因。本研究还得出了LDH水平对患者化疗疗效有较好的预测作用，但是灵敏度仅为45.94%，需要在今后的研究中开展联合检测以提升预测的灵敏度。

既往研究中EBV-DNA拷贝量均是原始数据[20]，由于部分患者拷贝量相对较大，可能会出现绝对值数较大而导致数据灵敏度下降，故本研究对EBV-DNA拷贝量取对数后进行比较，使数据更加平稳，降低范围过大引起的灵敏度下降、数据共线性及异方差等问题。通过取对数后的拷贝量分析结果显示，治疗前EBV-DNA拷贝量、治疗前后EBV-DNA拷贝量比值对NC患者化疗疗效均有一定预测价值，治疗前后EBV-DNA拷贝量比值对预后的预测效果更好。采用EBV-DNA动态监测价值与NC的关系在王勇利等[21]的研究中已经得到了证实，其相对于单个时间点EBV-DNA拷贝量监测具有更好的客观性。NC患者EBV-DNA拷贝量与肿瘤负荷存在一定关系，但部分患者由于个体原因造成对化疗不敏感而导致病灶未得到有效缓解，从而可能出现治疗前EBV-DNA拷贝量较高的患者由于敏感程度较高，治疗后该指标下降较明显，而部分治疗前该值较低的患者，可能出现治疗后缓解不明显导致该指标较高的情况。虽然既往有研究指出治疗前后EBV-DNA拷贝量与患者治疗疗效均有一定相关性[22-23]，但受上述因素的影响会导致预测出现偏差。加之治疗前EBV-DNA拷贝量对治疗后的拷贝量也存在明显影响，单纯使用某个时间点的拷贝量可能会受其他因素的干扰而导致预测不准确。通过动态监测并计算治疗前后EBV-DNA拷贝量比值，能较好地反映治疗前后EBV-DNA拷贝量的改变情况，同时有效排除基线指标对治疗中相关指标的影响，故对于疗效有更好的预测价值。

本研究为单中心小样本研究，同时由于时间及实验经费限制，对于患者EBV-DNA动态监测时间点相对有限，故结果可能存在偏倚；EBV-DNA拷贝量动态监测指标预测NC患者化疗疗效的灵敏度仅为53.22%，还有进一步提升的空间。但本研究对EBV-DNA拷贝量动态监测指标与NC患者化疗疗效之间的相关性结果是肯定的，这能为今后临床工作中对提升NC患者治疗后疗效评价的准确性提供参考，同时也会在今后进一步扩大样本年龄、疾病分期等影响疗效指标的取样范围，对本结果进行深入验证。

综上所述，EBV-DNA拷贝量动态监测指标对晚期NC患者化疗疗效有较好的预测价值，可以将其纳入评价NC患者化疗的体系中。