化瘀止血胶囊的薄层鉴别及急性毒性实验研究

谢嘉驰 罗黎霞 罗纯清 杨 宁

湖南省湘潭市中医医院药学部，湖南 湘潭 411100

化瘀止血胶囊处方来源于我院医生的长期临床实践总结，并以协定处方的形式在院内使用多年。由三七、白及、蒲黄炭、延胡索四味药组成，具有化瘀止血、消肿定痛功效，临床上治疗胃出血疾病效果显著。为解决汤剂给临床用药带来的不便，我院按照相关技术原则将其开发成院内制剂——化瘀止血胶囊。本课题组前期已对大鼠胃出血模型进行了临床实验研究，结果显示化瘀止血胶囊具有良好的疗效。

此外，查阅国内文献，发现三七制剂可能引发胃肠道刺激[1]、出血、过敏反应[2]，其中以皮肤损害最为常见[3]；延胡索制剂可致严重药物性肝损伤[4-6]，这些制剂的不良反应是影响临床安全用药的重要因素。因此，为控制该制剂产品质量，保证临床疗效和安全用药，本课题对三七、延胡索进行了薄层色谱鉴别，并参照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》的相关规定[7]，采用大鼠急性毒性试验探讨其安全性[8-9]，为该制剂的质量控制及临床用药安全提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 PL2001-L型电子天平(上海甄明科学仪器有限公司)；SKG-01型电热恒温鼓风干燥箱(湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司)；DS-0405超声波清洗机(深圳品凰科技有限公司)；CX23LEDRFSIC显微镜[奥林巴斯(中国)有限公司]，CP214型电子天平(美国Ohaus公司)；ZF-2型三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)。

1.2 材料 三七对照药材(批号：120941-201108)、延胡索对照药材(批号：120928-201311)由中国食品药品检定研究院提供。化瘀止血胶囊(湘潭市中医医院制剂室，批号：20131201)；羧甲基纤维素钠(上海山浦化工有限公司，批号：20141201)；甲醇(天津科赛欧，批号：200304)；甲苯(国药集团，批号：20180111)；乙酸乙酯(批号：20181129)、二氯甲烷(批号：20201212)，均购自于广东光华科技有限公司；正丁醇(批号：20220305)、乙醚(批号：20220319)、丙酮(批号：20190105)，均购自于天津富宇精细化工有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.3 动物 SPF级雌雄各半的费城癌症研究所(简称：ICR)小鼠各20只，小鼠重量：18.0～20.0 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，试验动物生产许可证号：SCXK(湘)2013-0004。动物实验室温度：20～26 ℃，动物实验室湿度：40%～70%，换气次数：≥15次/h，动物试验流程及相关操作遵守《实验动物管理条例》。

2 方法与结果

2.1 三七的薄层鉴别 取内容物5 g，加40 mL甲醇，超声30 min，过滤，滤液蒸干，加水20 mL使残渣溶解，每次用20 mL水饱和的正丁醇萃取，萃取3次，将正丁醇液合并，用20 mL氨试液洗涤，再用20 mL饱和的水正丁醇洗涤，洗涤2次，将正丁醇液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，即为供试品溶液。另取缺三七阴性样品，同法制成缺三七阴性样品溶液。再取三七对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照2015版《中国药典》(四部通则0502)试验，分别吸取4 μL的供试品、阴性样品、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)的下层溶液为展开剂，10 ℃以下放置2 h，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰。如图1所示。

1 2 3 4 51.阴性样品溶液；2.三七对照药材溶液；3～5.供试品溶液图1 三七TLC鉴别图

2.2 延胡索的薄层鉴别 取内容物10g，研细，加50 mL甲醇，超声30 min，过滤，滤液蒸干，加10 mL水使残渣溶解，加浓氨试液调至碱性，用 10 mL 乙醚振摇萃取，萃取3次，将乙醚液合并，蒸干，加1 mL甲醇使残渣溶解，即为供试品溶液。另取缺延胡索阴性样品，同法制成缺延胡索的阴性样品溶液。再取延胡索对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。照2015版《中国药典》(四部通则0502)试验，分别吸取上5 μL的供试品、阴性样品、对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶2)为展开剂，展开，晾干，再置于碘缸中约3 min取出，将板上吸附的碘挥尽后，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。如图2所示。

1 2 3 4 51.阴性样品溶液；2.延胡索对照药材溶液；3～5.供试品溶液图2 延胡索TLC鉴别图

2.3 小鼠急性毒性试验[10-18]

2.3.1 最大给药量实验 将雌雄各20只SPF级ICR的小鼠按性别、体重随机方法分为两组，即为空白对照组和化瘀止血胶囊组。实验前禁食12 h以上，按40 mL/kg剂量经口灌胃分别给予空白对照品组和化瘀止血胶囊组，给药当日给药2次，间隔6 h，化瘀止血胶囊组累积剂量为10.0 g生药/kg，具体试验剂量及分组情况见表1。给药当天，尤其在给药后0～4 h内密切观察并记录各组小鼠一般活动状况、中毒表现和特点、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等。然后每天观察1次，连续观察14 d。分别于给药前及给药后第7天、第14天，使用电子天平对小鼠体重进行称量。所有小鼠在试验结束后腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉处死，并予以大体解剖，肉眼观察各脏器的位置、大小、色泽、粘连等情况，并检查脏器表面和切面的质地、积液及肿瘤等异常改变。在试验过程中若有非计划死亡的动物(包括濒死动物)，均应进行大体解剖。

表1 试验剂量及分组设计

2.3.3 结果

2.3.3.1 一般活动状况及死亡情况 在灌胃给药后0～4 h内和连续14 d观察期间，空白对照组和化瘀止血胶囊组小鼠自主活动如常，未见明显异常和死亡现象。

2.3.3.2 体重变化情况 分别于给药前、给药后第7天和第14天称重，结果与空白对照组比较，化瘀止血胶囊组小鼠体重变化无显著性差异，且体重在正常增长范围内，说明ICR小鼠经口灌服化瘀止血胶囊，给药当日给药2次，累积剂量10.0生药/kg，对小鼠体重增长无明显影响。具体见表2、表3、表4。

表2 化瘀止血胶囊对小鼠体重影响

表3 化瘀止血胶囊对雌性小鼠体重影响

表4 化瘀止血胶囊对雄性小鼠体重影响

2.3.3.3 大体解剖检查结果 肉眼观察各脏器表面和切面均未见明显异常情况。

3 讨论

化瘀止血胶囊方中三七化瘀止血、活血止痛，为君药；白及收敛止血、消肿生肌，止血同时促进恢复，延胡索活血、行气、止痛，两者配合三七化瘀止血，行气止痛，为臣药；蒲黄止血、化瘀，调血而兼止，为佐药。诸药合并，化瘀止血、消肿定痛。根据湖南省药品监督管理局《湖南省医疗机构应用传统工艺配制中药制剂备案管理实施细则》的规定，薄层鉴别应首选处方中君臣药。故采用TLC法鉴别化瘀止血胶囊中三七、白及、延胡索药味，建立其TLC色谱方法学研究。

在三七的薄层鉴别试验中，参考《中国药典》2015版一部，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)为展开剂，结果发现该展开剂中三氯甲烷毒性大。后经查阅文献，选用二氯甲烷代替三氯甲烷为展开剂进行试验，结果显示斑点清晰，专属性强，且展开剂毒性降低，故纳入质量标准。在延胡索的薄层鉴别试验中，选用延胡索对照药材作为对照，结果显示，与对照品色谱相应的位置上，主斑点明显，故纳入质量标准。处方中白及薄层分离效果差，且阴性干扰严重，故未列入质量控制标准。因此，将三七、延胡索列入质量标准。经试验，该方法操作简便、准确度高、重复性好、专属性强。

本课题组在前期已对化瘀止血胶囊的止血治疗作用进行了研究，显示对胃出血其具有较好的治疗作用。在肯定其疗效的前提下，对该制剂的安全性进行评价。结果在本试验条件下，ICR小鼠经口灌胃给予化瘀止血胶囊(0.125 g生药/mL)，最大剂量40 mL/kg，每天给药2次(累积剂量为10.0 g生药/kg)，对其一般活动状况和体重量增长无明显影响，未见明显急性毒性反应。根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》[10]，计算出小鼠最大给药量相当于70 kg成人临床拟用量的130倍，提示化瘀止血胶囊口服用药安全性较高，可为临床应用安全性提供依据。