正交试验优化消乳增生软膏的提取工艺研究

罗 川 皮凤娟 张庆莲 许 曾 张盛敏

四川省泸州市中医医院药剂科，四川 泸州 510500

乳腺增生为常见乳腺疾病，又称“乳腺结构不良”“纤维囊性乳腺病”，属病理性增生，主要表现为正常乳腺小叶的生理性增生与复旧不全及乳腺正常结构出现紊乱[1]。其主要临床表现为乳房肿块和胀痛，是一种既非炎症又非肿瘤的增生性病变[2]，其发病率占乳腺疾病的首位[3]。消乳增生软膏为我院协定处方，原方为散剂，用水调匀后直接外敷于痛处，起到软坚散结，活血止痛的效果。本方用药精炼，但各中药成分药效有所差异，因此在对本复方的提取工艺研究中不能只以单味药材的提取工艺作为参照，而应考虑本复方的整体性。本文根据中药复方的整体性，在保留传统中药散剂特点的基础上[4]，分别以有效成分陈皮和芥子中的橙皮苷[5]、芥子硫氰酸盐含量及干浸膏得率为指标，采用单因素实验法和正交实验法对其制备工艺进行研究，为以后开发成院内制剂奠定基础。

1 仪器与材料

1.1仪器 FA2004万分之一电子天平(上海安亭电子仪器厂)，GZX-GF101-3BS-Ⅱ/H电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，HH数显恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)，CQ-250A-DST超声清洗仪(上海跃进医用光学器械厂)，ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)，1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.2 材料 芥子硫氰酸盐对照品(批号111702-202107，含量以100%计)、橙皮苷对照品(批号110721-202019，含量以95.3%计)均购自中国食品药品检定研究院；陈皮(批号210700791)、芥子(批号190700581)、肉桂(批号210701091)等均由成都市康美药业生产有限公司提供，山奈(批号200924-1)和穿破石(批号190910-1)由泸州百草堂中药饮片有限公司提供，胡椒(批号20070103)由四川国强中药饮片有限公司提供。上述试药经检验均为真品，所使用的试剂等级：乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 单因素考察

2.1.1 吸水率考察 按照处方量称取药材共96 g，加入1000 mL水浸泡，分别在10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min测定滤液体积。吸水率=(1000-滤液体积)/1000。测定该处方吸水率为11%。

2.1.2 加水量考察 按照处方量的两倍准确称量药材(丁香、陈皮、肉桂等)3份，固定浸泡时间为30 min，提取次数为1次，加水量依次为6倍、8倍、10倍，提取7 h，并记录每小时挥发油的体积，挥发油总体积分别为3.4 mL、2.9 mL、2.5 mL。结果表明：在加水量为6倍时所提取到的挥发油较多。故选择加水量为6倍。结果如图1所示。

图1 加水量对挥发油提取体积的影响图

2.1.3 浸泡时间考察 准确称量两倍处方量的药材(肉桂、陈皮、丁香等)3份，固定提取次数为一次，加水量为6倍[6]，浸泡时间分别为1 h[7]、1.5 h，提取7 h，并记录每小时挥发油的体积，挥发油总体积分别为3 mL、2.8 mL。综合2.1.1浸泡30 min的结果，表明：在浸泡时间为30 min时所得挥发油较多，故选择浸泡时间为30 min。结果如图2所示。

图2 浸泡时间对挥发油提取体积的影响图

2.1.4 提取时间考察 结合2.1.1和2.1.2两个实验，在提取时间超过5 h后，挥发油体积增长缓慢，考虑到生产成本等因素，故选择最佳提取时间为5 h。结果如图3所示。

图3 提取时间对挥发油提取体积的影响图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX-SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：1 mL/L乙腈∶含0.1%磷酸的0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液(20 ∶80)。柱温：30 ℃。检测波长0～7 min ∶326 nm。7～15 min ∶283 nm；流速：1 mL/ min[8-10]。进样量10 μL。

A.橙皮苷对照品溶液；B.芥子硫氰酸盐对照品溶液；C.供试品溶液；D.缺芥子阴性对照品溶液；E.缺陈皮阴性对照品溶液图4 专属性考察高效液相色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 芥子硫氰酸盐对照品溶液的制备：取芥子硫氰酸盐对照品适量，精密称定，加不含0.1%磷酸的流动相制成每1 mL含0.22 mg的对照品贮备液[11]，精密量取对照品贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，用不含0.1%磷酸的流动相稀释并定容，即得；橙皮苷对照品溶液的制备：取适量橙皮苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.52 mg的对照品贮备液，精密量取对照品贮备液1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，即得。

芥子阴性对照品溶液的制备：除去芥子以外的其他药材，按优选提取工艺制备阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。陈皮阴性对照品溶液的制备：取除去陈皮以外的其他药材，按优选提取工艺制备阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取正交实验项下制备的溶液5 mL，共9份，置于具塞锥形瓶中，水浴蒸干后加入甲醇10 mL，精密称定，超声 45 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得[11]。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性实验 分别精密量取2.2.2项下的芥子硫氰酸盐对照品溶液、橙皮苷对照品溶液、缺芥子阴性对照品溶液、缺陈皮阴性对照品溶液和2.2.3项下的供试品溶液，各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件检测。结果对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间均有出峰，阴性对照无干扰，如图4。说明该测定方法专属性强，无干扰。

2.2.4.2 线性范围考察 精密量取2.2.2项下的芥子硫氰酸盐对照品贮备液和橙皮苷对照品贮备液各1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分别置于10 mL容量瓶中，芥子硫氰酸盐对照品贮备液用不含0.1%磷酸的流动相，橙皮苷照品贮备液用甲醇稀释并定容，按2.4.1项下的色谱条件进样测定，以进样量(X，μg)为横坐标，得回归方程分别为：y1=614.14x-49.4，r=0.9999(n=8)，y2=974.1x-28.711，r=0.9999(n=8)。结果表明：芥子硫氰酸盐在0.22～1.76 μg内，橙皮苷在0.52～4.16 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4.3 精密度实验 精密量取2.2.2项下芥子硫氰酸盐对照品溶液和橙皮苷对照品溶液，分别重复测定6次，结果芥子硫氰酸盐、橙皮苷峰面积的RSD值分别为0.69%，0.72%，表明该方法精密度良好。

2.2.4.4 稳定性实验 精密量取2.2.2项下芥子硫氰酸盐对照品溶液和橙皮苷对照品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h和8 h分别进样10 μL，记录峰面积，计算RSD分别为0.56%，0.78%，结果表明芥子硫氰酸盐和橙皮苷对照品均在8 h内稳定。

2.2.4.5 重复性实验 取同一批样品6份，照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算含量。结果芥子硫氰酸盐对照品溶液和橙皮苷对照品溶液的RSD值分别1.2%和1.1%，表明本方法的重复性良好。

2.2.4.6 加样回收率实验 精密量取已知芥子硫氰酸盐和橙皮苷含量的样品2.5 mL，分别取6份，置于具塞锥形瓶中，每份均精密加入浓度为0.5180 mg/mL橙皮苷对照品储备液5 mL，浓度为0.2208 mg/mL芥子硫氰酸盐对照品储备液5 mL，照2.2.3项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件平行操作测定，记录峰面积，计算回收率，结果RSD<3.0%，说明加样回收率好。

2.2.5 品的含量测定 分别精密吸取2.2.2项下制备的对照品溶液和2.2.3项下制备的供试品溶液各10 μL，按2.2.1项下的色谱条件进样测定，计算样品中橙皮苷和芥子硫氰酸盐的含量。

2.3 干浸膏得率的测定 精密量取正交项下制备的提取液每个25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，再置于105 ℃烘箱中恒重，计算干浸膏得率[12]。

2.4 正交实验 考虑本次试验是采用水做溶剂，因此选择加水量、提取时间和提取次数作为正交实验的考察因素，将干浸膏得率和药液中的芥子硫氰酸盐含量、橙皮苷含量作为考察指标进行综合评定，应用L9(34)正交实验表进行实验，因素与水平表见下表1。按照L9(34)正交实验设计要求，准确称取处方量药材 (陈皮、丁香、肉桂等)，共9份，编为1～9号。 先按照单因素试验的最佳提取条件，进行挥发油提取，将提取好挥发油的药材弃去药液，留下药渣待用，向上述药渣中加入处方中余下药材，按照表1因素加水进行提取，将提取液过滤、冷却和定容。结果见表2。

表1 提取工艺的因素与水平

表2 正交实验设计与结果

2.5 多指标评分方法建立 实验以芥子硫氰酸盐和橙皮苷的含量及干浸膏得率作为权重系数依据，将芥子硫氰酸盐和橙皮苷的含量权重系数分别设置为0.3，将干浸膏得率的权重系数设为0.4。综合评分=(各组芥子硫氰酸盐含量/芥子硫氰酸盐最高含量×0.3×100)+(各组橙皮苷含量/橙皮苷最高含量×0.3×100)+(各组干浸膏得率/干浸膏最高得率×0.4×100)。

2.6 方差分析结果 由方差结果分析可知，各因素影响芥子中芥子硫氰酸盐及陈皮中橙皮苷提取量的排序B>C>A。结果表明，加水量A对橙皮苷和芥子硫氰酸盐的含量和干浸膏得率影响不显著 (P>0.05)，但提取次数B和提取时间C对橙皮苷和芥子硫氰酸盐的含量和干浸膏得率影响均具有显著性 (P<0.01)。因此确定最佳提取工艺条件为A1B2C1，即加6倍量水，煎煮2次，每次15 min。结果见表3。

表3 方差分析结果

2.7 验证实验 由于正交实验中筛选的最佳条件为6倍加水量，提取两次，每次15 min，做1组验证实验。考虑到本次试验提取时间短，且提取次数无显著性影响，因此在考察提取时间1 h和1.5 h，从验证结果来看，提取时间为1.5 h时含量较高，1 h次之，15 min含量最少，但提取1.5 h的比提取1 h的时间成本高，且多出的有效成分有限，为减少资源浪费，最终选择的最佳提取工艺条件为：加水量6倍，提取2次，每次1 h。结果见表4。

表4 验证实验结果

3 讨论

在此次提取工艺研究实验中，因需考察两个有效成分的含量，故选用合适的高效液相色谱条件比较重要，最初采用的流动相条件为乙腈：0.08 mol/L 磷酸二氢钾溶液(10∶90)，在此条件下芥子硫氰酸盐对照品的保留时间长，且存在拖尾现象。后将流动相比例调整为20∶80，保留时间合适，但也存在拖尾现象，因此向流动相中加入0.3%的三乙胺溶液，拖尾现象也未解决。查阅资料后，因芥子硫氰酸盐显酸性，故向流动相中加入0.1%的磷酸调整PH，拖尾现象得以解决。也曾考察不同的色谱柱[ZORBAX-SB-C18柱，Speax Bio-C18柱，Eclipse XDB-C18柱，Speax MS-C18柱]，对峰型和分离度的影响，结果显示ZORBAX-SB-C18柱的峰型和分离度最好。研究所确定的色谱条件，可为后续含芥子和陈皮的实验研究提供参考。

从单因素结果来看，当加水量在6倍时，所得的挥发油含量较高，表明在相同时间内，6倍加水量的挥发油提取效率最高。此外，在浸泡时间考察中，浸泡30 min即达到挥发油提取的最大值。提取时间在4～6 h之间呈现平稳趋势，在6h时达到峰值，但在提取时间超过5 h后，挥发油体积增长缓慢，考虑到生产成本等因素，故选择最佳提取时间为5 h。由上述结果可以看出，该处方中所含的挥发油易于提取，适合大生产。

消乳增生软膏为我院协定处方，具有软坚散结，活血止痛的效果，原方为散剂，存在剂量不准确，难保存且患者依从性低的缺点，本实验通过采用单因素和正交试验相结合的方式对消乳增生软膏的提取工艺进行研究，确定了消乳增生软膏的最佳提取工艺，提高了有效成分含量，从验证结果来看，提取时间为1.5 h时含量较高，1 h次之，15 min含量最少，但提取1.5 h的比提取1 h的时间成本高，且多出的有效成分有限，为减少资源浪费，最终选择的最佳提取工艺条件为：加水量6倍，提取2次，每次1 h。但本次试验提取方法单一，下一步打算验证其不同提取方法下有效成分的含量变化。