苦豆子凝胶薄层色谱鉴别研究

郭鸿雁 李 军

宁夏职业技术学院，宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心，宁夏 银川 750021

为完善该制剂质量标准中鉴别项的内容，参考2020年《中国药典》中药及制剂鉴别的薄层色谱法[9]与相关文献[10-13]，本研究优化了供试品制备方法、展开剂、点样量等色谱条件，完成了专属性和不同温湿度、不同薄层板的耐用性等方法学验证，建立了苦豆子凝胶剂的薄层色谱鉴别法，为制定该凝胶剂的质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 XP205电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；DHG-9070A恒温干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；明澈-D 24超纯水系统(美国默克密理博有限公司)；200 mm×200 mm薄层色谱双槽展开缸(上海信仪仪器厂)。

1.2 材料 硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限司，批号：20210418)、高效硅胶HSG板(烟台江友硅胶开发有限公司，批号：20211013)、硅胶G薄层板(青岛海胜精细硅胶化工有限公司，批号：20210814)，二氯甲烷、甲醇、氨水、乙酸乙酯、冰醋酸、碘化钾、碱式硝酸铋钾等试剂均为分析纯，纯化水为自制。槐定碱(中国食品药品检定研究院，批号110784-201706)和苦参碱(中国食品药品检定研究院，批号110805-202010)。槐定碱1.111 mg/mL、苦参碱1.540 mg/mL。中试三批苦豆子凝胶(批号2022092701、2022112501、2022112502)为委托银川凤仪堂生物工程有限公司制备，不加苦豆子总碱的空白凝胶阴性对照为宁夏中药材开发与利用工程技术研究中心自制。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 制剂及原料供试品的制备 分别取三批苦豆子凝胶三支，分别称取0.2 g加甲醇25 mL溶解过滤，收集滤液，备用；称取0.1 g苦豆子总碱加甲醇50 mL溶解过滤，收集滤液，备用。

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取槐定碱和苦参碱对照品加甲醇定容至10 mL，制备1.111 mg/mL的槐定碱和1.540 mg/mL苦参碱。

2.1.3 阴性对照溶液制备 取自制的不含苦豆子总碱空白凝胶剂，按2.1.1项下制制备阴性对照溶液。

2.1.4 碘化铋钾试液制备 取碱式硝酸铋钾 0.85 g，加冰醋酸10 mL与水40 mL溶解后，加4%碘化钾溶液5 mL，加冰醋酸20 mL，用水稀释至100 mL，摇匀，备用。

不同临床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）患者的复发和转移率分别为44.0%、68.8%、100.0%和100.0%（图2B）；统计分析结果显示（表3），临床分期为Ⅲ和Ⅳ期患者术后复发和转移的发生率为100.0%，明显高于Ⅰ和Ⅱ期患者的53.7%，差异有统计学意义（P＝0.003）。Ⅰ和Ⅱ期患者复发和转移的发生率为44.0%与68.8%，差异无统计学意义（P＝0.064）。

2.2 试验方法 参照薄层色谱法(通则0502)试验[9]，吸取供试品溶液2～3 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。

2.3 薄层色谱条件的优化

2.3.1 展开剂的选择 吸取苦豆子凝胶和苦豆子总碱供试品、槐定碱和苦参碱对照品溶液各2 μL分别点于3个同一硅胶G薄层板上，分别以A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]，B[乙酸乙酯∶乙醇∶氨水(50∶1∶0.5)]，C[三氯甲烷∶甲醇∶石油醚∶氨水(50∶5∶1∶1)]为展开剂，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果显示，A与C作为展开剂，凝胶和苦豆子总碱供试品与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好，效果最佳。B展开效果欠佳。由于三氯甲烷的毒性较大，考虑安全环保。故选用A[二氯甲烷∶甲醇∶氨水(50∶6∶1)]作为展开剂。结果如图1。

1 2 3 41 2 3 41 2 3 41.槐定碱；2.苦豆子总碱供试品；3.苦豆子凝胶供试品；4.苦参碱图1 不同展开剂考察结果图

2.3.2 供试品制备方法的考察 分别按照以下4种方法制备供试品溶液，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。①称取苦豆子凝胶0.2 g，加入纯化水超声溶解，定容至25 mL，滤过，得供试品溶液1。②称取苦豆子凝胶0.2 g，5滴10%CaCl2，摇匀后加入纯化水超声溶解，定容至25 mL，滤过，得供试品溶液2。③称取苦豆子凝胶0.2 g，加入甲醇超声溶解，定容至25 mL，滤过，得供试品溶液3。④称取苦豆子凝胶0.2 g，加入5滴10%CaCl2，摇匀后加入甲醇超声溶解，定容至25 mL，滤过，得供试品溶液4。结果表明∶ 4种方法制备的供试品溶液主斑点与对照品溶液斑点的颜色、位置相同，均有较好的分离度。故供试品溶液制备方法选择简单、易操作的第3种。如图2所示。

1 2 3 4 41 2 5 61.槐定碱；2.苦参碱；3.供试品1；4.供试品2；5.供试品3；6.供试品4图2 不同供试品制备方法的考察结果图

2.3.3 不同点样量的选择 选用硅胶G薄层板，取样品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL分别点样，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果显示：对照品溶液和供试品溶液点样量在1～6 μL范围内，均能分离，各斑点清晰，其中1～3 μL分离度较好，考虑不同制剂含量差异，故选择点样量为2～3 μL。结果如图3所示。

1 2 3 4 5 61.对照品(下是槐定碱、上是苦参碱)；2～6分别为1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、6 μL图3 不同点样量的考察结果图

2.4 苦豆子凝胶薄层色谱鉴别的方法学验证

2.4.1 专属性考察 分别吸取2批次的苦豆子凝胶供试品溶液、苦豆子总碱溶液、阴性对照溶液、混合对照品溶液各3 μL分别点与同一硅胶G薄层板上，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。供试品、苦豆子总碱与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且斑点清晰，分离度好。而阴性样品溶液无干扰。说明该薄层色谱鉴别方法专属性强。结果如图4所示。

1 2 3 4 51.混合对照品(上为苦参碱、下为槐定碱)；2.苦豆子凝胶(批号22092701)；3.苦豆子凝胶(批号22112501)；4.苦豆子总碱；5.阴性对照溶液图4 苦豆子凝胶薄层色谱鉴别的专属性考察结果图

2.4.2 薄层色谱方法耐用性考察

2.4.2.1 不同厂家硅胶G薄层板的考察 分别在3个不同生产厂家硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司、烟台江友硅胶开发有限公司、青岛胜海精细硅胶化工有限公司)点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果在3个不同品牌的硅胶G薄层预制板上，样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上，显相同斑点，且斑点清晰，分离度良好。表明不同厂家生产硅胶G薄层板对薄层色谱鉴别方法无明显影响。结果如图5所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 5A.青岛海洋；B.烟台江友；C.青岛胜海；1.槐定碱；2.苦参碱；3.苦豆子凝胶(批号22092701)；4.苦豆子凝胶(批号22112501)；5.苦豆子凝胶(批号22112502)图5 不同厂家硅胶G板薄层色谱图

2.4.2.2 不同温度的考察 在同一厂家薄层硅胶G板上点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，在10 ℃、20 ℃、35 ℃ 3个不同温度下，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果展开样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点，且斑点清晰，分离度好。表明不同温度的对薄层鉴别无影响。结果如图6所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定碱；2.苦参碱；3.苦豆子凝胶(批号22092701)；4.苦豆子凝胶(批号22112501)；5.苦豆子凝胶(批号22112502)图6 不同温度的薄层色谱图

2.4.2.3 不同湿度的考察 在同一厂家薄层硅胶G板上点样3个批次供试品及槐定碱和苦参碱对照品，在32%、58%、88% 3个不同湿度下，按2.2项下方法考察其对薄层色谱的影响。结果展开样品色谱中在与槐定碱、苦参碱对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点。表明不同湿度对薄层色谱鉴别方法基本无影响。结果如图7所示。

1 2 3 4 51 2 3 4 51 2 3 4 51.槐定碱；2.苦参碱；3.苦豆子凝胶(批号22092701)；4.苦豆子凝胶(批号22112501)；5.苦豆子凝胶(批号22112502)图7 不同湿度的薄层色谱图

3 讨论

本研究建立苦豆子凝胶薄层鉴别方法，确定以槐定碱和苦参碱为对照品，以甲醇为溶剂制备供试品溶液，点样量2～3 μL，以二氯甲烷∶甲醇∶氨水=50∶6∶1为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，日光下检视。

苦豆子凝胶剂作为新开发的用于防治痤疮的制剂，其主要有效成分为槐定碱和苦参碱，且两者的含量最高，故薄层色谱鉴别选择槐定碱和苦参碱为对照品[14]。薄层色谱鉴别是中药制剂鉴别的主要方法之一，因其设备简单、操作方便而被广泛应用[15]，但易受供试品制备方法、点样量，展开剂等相关条件影响[16-17]。因此，本研究优化了上述条件，确定了供试品制备用甲醇溶解，点样量为2～3 μL。由于三氯甲烷毒性较大，考虑实验人员的安全性和环保问题[18-19]，改用二氯甲烷，并进行了展开剂比例的优化调整，最终以二氯甲烷：甲醇：氨水(50∶6∶1)为展开剂，薄层色谱分离效果最好，且低毒安全，这也符合目前质量标准制定的基本要求[20]。作者在实验过程中发现，点样后薄层板再展开之前必须进行充分饱和，至少30 min，防止薄层色谱图产生边缘效应。可能的原因是充分饱和后，使展开缸中的展开剂气、液、固三相比例适当，斑点分离度较好[21]。

为了考察方法的专属性和耐用性，分别考察了阴性对照溶液、不同温度、不同湿度、不同厂家生产的硅胶G板等对所建立的苦豆子凝胶薄层色谱鉴别方法的影响。结果显示，阴性对照、不同温湿度和不同厂家薄层板的3批苦豆子凝胶供试品的色谱图均与对照品色谱图相应位置上显相同的颜色斑点，且斑点清晰，分离度好，效果佳，阴性无干扰。

本研究建立的苦豆子凝胶薄层色谱鉴别法操作简便可行、专属性强、重现性好，结果准确可靠，所用试剂安全环保，是控制苦豆子凝胶制备工艺、产品质量的快速检测方法，为制定苦豆子凝胶剂的质量标准提供了重要依据。