UPLC-Q-TOF/MS结合化学计量学对不同产地香圆主要成分的研究

陈 婷 张 文 朱仁愿 续艳丽 彭 涛

兰州市食品药品检验检测研究院/甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心，甘肃 兰州 730050

香橼为芸香科植物枸橼 (CitrusmedicaL.)或香圆(CitruswilsoniiTanaka)的干燥成熟果实，具有理气和中、化痰止咳、抗菌、抗炎、抗过敏的功效[1]，用于缓解胃腹胀痛、呕吐、咳嗽等症[2-3]。《中国药典》所收载的药用正品香橼有枸橼和香圆两种[4]，香圆药材资源分布广泛，果实来源丰富，主产于四川、广东、广西、云南等地，由于香圆产地广泛且栽培品种繁多，市场上药材质量差异较大[5-6]，药典中香橼仅以香圆中柚皮苷为含量测定及鉴别对象，并不能完全反映药材的品质，因此建立一种简单有效的分析方法对不同产地香圆进行质量评价显得尤为重要。

目前，液相-飞行时间质谱仪(LC-Q/TOF)因具有灵敏度高、准确率高、分辨率高等特点，能够在线分析和鉴定复杂成分，尤其是飞行时间质谱仪可精确测定分子的质量数，特别适用于中药及复方未知化合物的分析与鉴定[7-8]。现存关于香圆的研究报道主要集中在部分成分如橙皮苷和柚皮苷等的含量测定及其指纹图谱的研究，所用分析技术多为液相色谱法等[9-10]。随着数据分析技术的发展，高分辨质谱结合化学计量学分析已经逐渐应用于中药材的质量评价中[11-12]。然而针对不同产地香圆的差异化学成分所进行的高分辨质谱研究尚未见报道。因此本文采用超高效液相色谱与高分辨质谱相结合，快速、高效、精确地采集和分析不同产地香圆的化学成分，同时结合多元统计分析方法对不同产地香圆进行对比分析，找出各组之间的差异化学成分，为香圆的产地鉴别和品质分类提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1290超高效液相色谱/6546四极杆-飞行时间质谱仪(美国安捷伦公司)，配有双电喷雾离子源(dual Jet Stream ESI)；ME204/02电子天平(美国梅特勒公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；Centrifuge 5810R高速离心机(德国Eppendorf公司)；SBL-10T型超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；FW135 型中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

甲醇、乙腈、甲酸为质谱纯，其他试剂均为分析纯，试验用水为Milli-Q超纯水。香圆药材来源为产地采购(安徽、四川、云南、浙江、广西)，共25批，样本均经兰州市食品药品检验检测研究院中药室鉴定为香圆。

1.2 供试品溶液的制备 精密称取香圆样本粉末(过三号筛)各50 mg，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声提取30 min，取出，放置冷却，称重，用甲醇补足失重，离心(4000 r/min，15 min)，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1mm×100 mm，3.5 μm)。流动相0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液(A)-乙腈溶液(B)；梯度洗脱(0～6 min，5%～30% B；6～16 min，30%～95% B；16～20 min，95%～5% B；20～23 min，5% B)；柱温40 ℃；流速0.4mL/min，进样量2 μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，在正/负离子模式下分别采集数据。干燥气温度325 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力3.1×105Pa；毛细管电压4000 V；喷嘴电压500 V；鞘气温度325 ℃；鞘气流速11 L/min；扫描范围：m/z50～1000。

1.4 共有差异化学成分的鉴定及统计分析 取香圆样品，制备供试品溶液，按“1.3”的方法进行质谱数据采集，根据总离子流图所得化合物的精确分子质量信息，通过比对精确相对分子质量和二级特征碎片离子，结合对照品、数据库检索及文献报道，确定或推测共有峰信息。采集的原始数据通过Mass Hunter Qualitative Analysis 进行分析处理，如保留时间校准、峰识别、峰对齐等，将数据矩阵导入SIMI-CA 14.1 软件，对香圆中的化学成分进行主成分分析(PCA)，观察样本的聚类情况，再采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行有监督的数据分析。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验 取500 μL供试品溶液，过0.22 μm滤膜，得样品溶液。分别选择6个不同保留时间的离子(考察的离子分别是161.05243、289.07901、305.0739、325.0920、461.1162、597.1814)，计算各离子的保留时间(tR)，质荷比(m/z)和归一化后峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察仪器方法的性能。重复测定5次，得到离子保留时间的RSD值依次为0.2%、0.3%、0.2%、0.1%、0.2%、0.4%，质荷比的RSD值均为0%，相对峰面积的RSD值依次为2.3%、1.6%、3.3%、1.2%、3.0%、4.1%，结果显示仪器精密度良好。

2.1.2 重复性试验 精密称取香圆样本粉末(过三号筛)，按1.2节方法制备5份供试品溶液，得到6个离子保留时间的RSD值分别为0.3%、0.2%、0.4%、0.1%、0.3%、0.5%，质荷比的RSD值均为0%，相对峰面积的RSD值分别为4.2%、3.3%、1.2%、1.4%、2.5%、3.0%，结果显示方法的重复性良好。

2.1.3 样品稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h测定，得到6个离子保留时间的RSD值分别为2.3%、0.5%、1.4%、0.1%、0.1%、1.1%，相对峰面积的RSD值分别为3.4%、2.8%、1.7%、4.0%、3.2%、1.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2 数据采集与成分鉴定 按照液相色谱质谱检测条件的要求，取供试品溶液进行采集分析。由于样品化学成分复杂，因此采用正负离子分别扫描的方法，实现多种化合物同时测定。以安徽产地样品为例，总离子流图如图1所示。通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件自动分析采集的原始数据，提取其总离子流色谱图(EICs)中所得化合物的精确分子质量信息，分析其二级碎片离子信息，通过对照品、化学数据库(CNKI SciFinder，ChemSpider等)及文献[13-20]报道进行检索，对各化合物进行初步鉴定，建立包括化合物名称、分子式和化学结构等信息的潜在化学成分数据库。利用已有对照品的保留时间和质谱信息进行成分鉴定，推测出伞形花内酯、橘皮素、柠檬苦素等29种共有化学成分，5个产地香圆样品共有化合物详细信息见表1。

a.TOF/MS TIC(ESI+)；b.TOF/MS TIC(ESI-)图1 安徽产地香圆样品TOF/MS总离子流色谱图

表1 香圆样品中化学成分的UPLC-Q-TOF/MS 结果

2.3 不同产地香圆化学主成分分析(PCA) 不同产地香圆中的29种化学成分的离子峰面积数据按照要求处理后，导入SIMCA-P 14.0软件进行PCA处理，得分图如图2所示。结果发现不同产地香圆样本群在得分图中处于不同的聚落，可以较好地区分且被明显分成了5组，说明不同产地香圆样本主要化学成分存在差异变化。各组样本点之间除广西样本外，其余离散性均较小，分布较为集中，表明广西产地样品的内部差异性较大，其余产地(安徽、四川、云南、浙江)香圆样品组内差异较小。

G.1～5广东；Y.1～5云南；S.1～5四川；Z.1～5浙江；A.1～5安徽图2 香圆药材样品的PCA分析得分图

2.4 不同产地香圆化学成分偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) 为了更好地观察样品组间差异，采用有监督的OPLS-DA模型对25批香圆进行分析，得分图如图3所示。由模型验证参数可知，数据矩阵的结实率参数R2(X)= 0.754，模型区分参数R2(Y)=0.958，模型预测参数Q2(cum)=0.930，说明75.4%变量可用来解释各组之间95.8%的差异，该模型的平均预测能力为93.0%，预测能力大于50%，且R2(Y)与Q2(cum)之间的差值为0.028，小于0.3，表明建立的模型稳定且有较强的预测能力。

G.1～5广东；Y.1～5云南；S.1～5四川；Z.1～5浙江；A.1～5安徽图3 香圆药材样品的OPLS-DA分析得分二维图(a)、三维图(b)、置换验证结果图(c)

为了验证模型的有效性，利用OPLS-DA模型置换交叉检验，经过800次交叉验证，结果R2与真实模型的R2Y值的一条回归线截距为0.0881 (<0.4)，Q2与真实模型Q2Y值的一条回归线截距为-0.443(<0.05)，结果显示模型未出现过度拟合现象，该模型具有显著的统计学意义(图3c)。图3a、3b结果显示，不同产地的香圆在OPLS-DA 图中呈现了各自的特定区域，分离效果明显。与无监督模式的主成分分析(PCA)结果相比较，5个产地的香圆样品得到更好地分离，且有助于寻找样品间的差异化学成分。为进一步确认样品分类差异贡献程度的大小，采用变量载荷评价参数值(VIP)进行评价，该值可以体现变量对模型的整体贡献水平。VIP值越大，表明变量的贡献程度越大，当VIP 值大于 1 时，化合物视为模型潜在的差异化学成分。本实验筛选出VIP 值>1的8个化学成分作为不同产地香圆差异性的主要化学标记物，包括金合欢素、柚皮苷、伞形花内酯、5，7-二羟基香豆素、儿茶素、橘皮素、橙皮素、辛弗林，是区分不同产地香圆最重要的化合物。

3 结论

本文对25批不同产地香圆药材进行了研究，建立了UPLC-Q-TOF/MS定性分析方法，分析香圆化学成分图谱并结合柚皮苷等对照品的保留时间和质谱信息等进行成分鉴定，共鉴定出29个成分。采用特征图谱信息结合化学计量学分析对25批不同产地香圆样品的主成分进行评价，通过PCA和OPLS-DA 对5个产地香圆药材进行了区分。结果显示，不同产地香圆样本群处于不同的空间聚落，可以较好地区分且被明显分成了5组，广西样品离散型较大，说明同一产地样品的内部差异性较大；安徽、四川、云南、浙江样品分布较为集中，组间差异较小；进一步采用VIP值法进行分析，本实验筛选出VIP 值>1的8个化学成分作为香圆差异性的主要化学标记物。

本文建立的HPLC-Q-TOF/MS高分辨质谱测定香圆中化学成分的定性方法简单、可靠，可较为全面的反应香圆化学信息，结合化学计量法对特征信息进行综合评价，使结果更为全面科学，且有助于从多组分体系的角度鉴别中药材品种，相互配合，为进一步的质量控制提供依据。