多指标综合评分法优化直缘乌头中草乌甲素渗漉提取工艺

汤泮泮 叶兴蓉 陆雪萍 李 龙 谢佳颖 冯莉萍 陈 旭 任 萍 陆礼和

云南省药物研究所云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 651000

草乌甲素是从天然植物中提取分离纯化得到的生物碱，具有较好的抗炎、镇痛及免疫调节作用，临床用于治疗风湿及类风湿性关节炎、肩周炎等[1]，与非甾体消炎镇痛药和阿片类镇痛药相比，草乌甲素的安全性较好[2-3]。从2005版、2010版、2015版、2020版《中国药典》二部均收载了草乌甲素原料及其制剂[4-7]，随着草乌甲素制剂在临床上的广泛应用，草乌甲素市场需求较旺盛，作为草乌甲素提取用原料药材需求量也不断增加。

目前草乌甲素只能从乌头属植物中分离得到，如滇西乌头(AconitumbulleyanummDiels)、粗茎乌头(AconitumcrassicauleW.T.Wang)[8]、长缘乌头(AconitummgeorgeiComber)[9]和直缘乌头(AconitumtranssectumDiels)[10]等，其中直缘乌头主要为工业生产草乌甲素的原料[11]。沈勇等[12-14]采用甲醇渗漉，张红彬[15]采用碱浸泡和石油醚回流提取，付彬彬[16]采用闪式提取草乌甲素，提取过程中碱性溶剂、有毒有害试剂回收利用较难把控，限制了工业化生产。本研究采用HPLC法建立了乙醇渗漉液中草乌甲素含量测定方法[17-18]，以草乌甲素转移率和干膏率作为指标进行综合评分，在单因素试验基础上通过正交试验[19]优化直缘乌头中草乌甲素渗漉提取工艺，为后续草乌甲素纯化研究提供技术支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；DHG-9145A电热鼓风干燥箱(上海一恒有限公司)；ME204/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SK-8200HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 材料 草乌甲素对照品(批号：100530-202103，含量以99.2%计)购于中国食品药品检定研究院；乙醇为食品级，三乙胺、磷酸、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，纯净水由Milli-Q纯水系统制备，其余试剂为分析纯。

直缘乌头药材(购于云南玉龙县)，经云南省药物研究所正高级工程师苏钛鉴定为毛茛科直缘乌头AconitumtranssectumDiels的干燥根，草乌甲素含量为0.18%(根据文献[11]自测)，批号：2020414。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液制备 取试验工艺中的渗漉液1 mL，加相应70%乙醇，并定容至10 mL量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取草乌甲素对照品10 mg，置于50 mL量瓶中，80%乙醇溶解定容至刻度，摇匀，分别精密吸取4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL、8.0 mL于10 mL量瓶中，80%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得(每1 mL分别含0.08 mg、0.10 mg、0.12 mg、0.14 mg、0.16 mg草乌甲素)。

A 对照品 B.供试品1 草乌甲素图1 草乌甲素HPLC色谱图

2.2 指标成分的测定

2.2.1 色谱条件 Ecosil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；0.2%三乙胺水溶液[用磷酸调节pH值(3.1±0.1)]-乙腈(60∶40)为流动相，检测波长260 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.2.2 线性关系考察 吸取“2.1.2”项下对照品溶液，以溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=13751X+19.1(R2=0.9995)，在0.08～0.16 mg/mL范围内线性关系良好。

教育资源是指为教学有效开展提供的各种可被利用的条件，通常包括教材、案例、影视、图片、课件等，也包括教师资源、教具、基础设施及相关教育政策等内容。通俗来讲，是指一切可以帮助学生达成学习目标的物化了的、显性或隐性的、可以为学生学习服务的教学组成要素。

2.2.3 精密度考察 精密吸取“2.1.2”项下草乌甲素对照品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算其峰面积的RSD值为2.1%，表明该仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性考察 取“2.1.1”项下供试品溶液分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算其峰面积RSD值为2.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 重复性考察 精密量取“2.1.1”项下供试品溶液6份，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算其含量RSD值为2.2%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密量取已知含量同一批渗漉液，平行取样6次，每份1 mL，精密加入等量草乌甲素对照品溶液，按照“2.1.1”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，计算草乌甲素的平均加样回收率为99.45%，RSD为2.7%。

2.3 干膏的测定 精密量取25 mL渗漉液至干燥恒重的蒸发皿，80 ℃水浴蒸干。常压105 ℃干燥至恒重，置干燥器冷却30 min，迅速称定重量，计算干膏重量。

2.4 评价指标 草乌甲素转移率越高，提取效果越好，可作为考察提取效果的主要指标，权重系数为 0.6，同时，干膏得率越小，说明杂质少，干膏得率可作为次要指标，权重系数为 0.4，因此以干膏得率和草乌甲素转移率为评价指标，对渗漉工艺进行综合评分[11-12]。

干膏得率=渗漉液总体积×干膏重量/(取样体积×原药材重量)

渗漉综合评分=干膏得率/最大干膏得率×40+草乌甲素转移率/最大草乌甲素转移率×60

2.5 单因素试验

2.5.1 粉碎度考察 取药材适量，粉碎，分别过4 mm、10 mm、24 mm、50 mm目筛各20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，装柱，加入5倍量80%乙醇，渗漉流速1 mL/min，浸泡时间16 h，摇匀，直接取渗漉液0.45 μm微孔滤膜过滤，结果发现，粉碎度10目筛时草乌甲素含有量最高及耗时较短，故选择其进行后续试验。

2.5.2 乙醇体积分数 取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量一定乙醇浓度湿润浸泡，浸泡时间16 h，装柱，加入5倍量相应乙醇浓度进行渗漉，渗漉流速1 mL/min，考察50%、65%、80%、95%乙醇浓度对提取效果的影响。结果见表1，乙醇体积分数对综合评分影响较大，随着乙醇体积分数的增加，综合评分先升高再降低，80%乙醇时综合评分最高。结合经济成本，选乙醇体积分数为70%、80%、90%乙醇作为正交试验的3个水平。

表1 乙醇体积分数对渗漉效果的影响

2.5.3 浸泡时间 取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，装柱，加入5倍量相应乙醇浓度进行渗漉，渗漉流速1 mL/min，考察浸泡时间4 h、8 h、16 h、24 h对提取效果的影响。结果见表2，浸泡时间对综合评分影响较大，随着浸泡时间的增加，综合评分趋势放缓，浸泡时间16 h时综合评分最高。结合经济成本，故固定浸泡时间为8 h、16 h、24 h作为正交试验的3个水平。

表2 浸泡时间对渗漉效果的影响

2.5.4 乙醇用量 取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，浸泡时间16 h，装柱，渗漉流速1 mL/min，考察乙醇用量5倍、7倍、9倍、12倍、17倍对提取效果的影响。结果见表3，乙醇用量对综合评分影响较大，随着乙醇用量的增加，综合评分趋势放缓，乙醇用量15倍时综合评分最高。结合经济成本，故固定乙醇用量为10倍、15倍、20倍作为正交试验的3个水平。

表3 乙醇用量对渗漉效果的影响

表4 渗漉流速对渗漉效果的影响

2.5.5 渗漉流速 取药材粉碎过10目筛20 g，3倍量80%乙醇湿润浸泡，浸泡时间16 h，加入12倍80%乙醇进行渗漉，考察渗漉流速0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min对提取效果的影响。结果见表3，渗漉流速对综合评分影响较大，随着渗漉流速的增加，综合评分趋势放缓，渗漉流速1 mL/min时综合评分最高。结合经济成本，故渗漉流速为1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min 作为正交试验的3个水平。

2.6 正交试验 在单因素试验基础上，取药材粉碎过10目筛20 g，以乙醇体积分数(A)、乙醇用量(B)、渗漉流速 (C)、浸泡时间 (D)为影响因素，进行4因素3水平L9(34)正交试验。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表5。

表5 因素水平

表6 渗漉工艺正交试验结果 (n=2)

即各因素最优水平分别为A1、B2、C2、D2。方差分析(表7)结果显示，因素A的F值为26.168，大于F0.05(2，2)=19.00，说明A(乙醇体积分数)对试验指标有显著性影响(P<0.05)，结合直观分析显示的A1水平较好，因此A因素选取A1水平，即渗漉提取的乙醇体积分数为70%。而B(乙醇用量)的F值为0.510、C(渗漉流速)F值为0.353均小于F0.05(2，2)=19.00，表明B和C因素对试验指标无显著性影响(P>0.05)。正交试验结果中综合评分显示，渗漉工艺为A1B2C2D2的评分最高，A因素为A1水平，与方差分析结果一致；B、C、D因素为 B2、C2、D2均取各水平的中间值，从渗漉效率和节约溶剂角度考虑也较为合理。综上，通过正交试验初步选择渗漉工艺条件为A1B1C2D2，即70%乙醇(3倍药材量)浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉(7倍药材量)，渗漉流速2 mL/min。

表7 正交试验结果的方差分析

2.7 渗漉工艺验证试验 取药材粉碎过10目筛20 g，平行3份，加入70%乙醇(3倍药材量)浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉(7倍药材量)，渗漉流速2 mL/min，计算草乌甲素转移率和干膏得率，结果见表8。结果显示，草乌甲素平均转移率为97.94%，RSD为0.66%；干膏平均得率为45.73%，RSD为 0.72%；平均综合评分值为97.94%；结果表明，3次试验结果和正交试验综合评分96%～97%之间，RSD值为0.66%，表明该提取工艺参数 A1B1C2D2稳定、科学、可行。

表8 验证试验结果 (n=3)

3 讨论

草乌甲素在临床上广泛应用，市场需求较旺盛，提升草乌甲素的提取效率，是一项重要的研究工作。预实验曾对渗漉法和回流法提取进行比较，结果发现渗漉法的草乌甲素转移率高，故选择渗漉法。本文先对渗漉提取中粉碎度、浸泡时间、乙醇体积分数、乙醇用量、流速进行单因素试验，再对乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉流速、浸泡时间进行正交试验。在粉碎粒度考察时，发现过细时，未能达到渗漉提取效果，耗时较长，转移率较低，故直缘乌头在渗漉提取过程中不宜粉碎过细，避免渗漉过程中发生堵塞柱筒现象，影响渗漉效果。最终，采用最佳渗漉工艺为最粗粉加70%乙醇(3倍药材量)浸泡时间16 h，再加70%乙醇渗漉(7倍药材量)，渗漉流速2 mL/min进行提取，耗时短，综合评分较高。该方法简便稳定、重复性好，为草乌甲素的进一步分离纯化与利用提供实验依据。