响应面法优化盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺

张文霞 康亚男

山东省德州市陵城区中医院，山东 德州 253500

覆盆子又名树倭泡、树莓、掌叶覆盆子，为蔷薇科植物华东覆盆子(RubuschingiiHu)的干燥果实[1]，一般在夏初果实由绿变绿黄时采收。覆盆子收载于2020版《中国药典》，味甘、酸，性温，具有益肾固精缩尿、养肝明目功效，主要防治阳痿早泄、遗尿尿频、遗精滑精、目暗昏花[2]。覆盆子含有黄酮、酚酸、萜类等成分[3-4]，具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫力等作用[5-7]，其药用既有生品，也有盐制品。据报道[8-9]，鞣花酸具有改善肾小管损伤及肾纤维化活性作用，覆盆子盐炙后补肾固涩作用显著增强，可能与盐炙后鞣花酸含量显著升高有关。目前，对盐炙品中鞣花酸的提取工艺研究还未见报道，本实验以鞣花酸的含量为评价指标，采用星点设计-响应面法优化盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺，以期为盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-2030C3D Plus高效液相色谱仪(岛津公司)；Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(安捷伦科技有限公司)；DF110电子天平(佑科仪器仪表公司)。

1.2 材料 鞣花酸(批号：111959-201708)购自中国药品生物制品检定所；覆盆子购于江西(批号20200426)，经本院药剂科康亚男主管药师鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子RubuschingiiHu的干燥果实。

2 方法与结果

2.1 盐覆盆子中鞣花酸的含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取鞣花酸对照品10.50 mg，置50 mL容量瓶中，加73%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为 0.21 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称定盐覆盆子粉末(过四号筛)1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入73%甲醇60 mL，称定重量，回流提取63 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 采用Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液(15：85)为流动相；流速1.0 mL·min-1；柱温 30 ℃；检测波长：254 nm；进样量10 μL。色谱图如图1。

A.对照品；B.供试品图1 HPLC色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL的容量瓶中，加入73%甲醇定容至刻度。按“2.1.3”项下色谱条件测定分析，以峰面积Y对进样浓度X计算回归方程，得回归方程Y=2.436X+0.023(r=0.9996)，表明在质量浓度0.0021～0.21 mg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分析，连续进样测定6次。结果鞣花酸峰面积RSD为1.41%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 取盐覆盆子供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件，在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 内进样分析，结果鞣花酸峰面积RSD为1.83%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

2.2.4 重复性试验 取盐覆盆子，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。结果鞣花酸平均含量为0.349%，RSD为0.69%，表明所建立的方法重复性好。

2.2.5 加样回收率试验 取盐覆盆子0.5 g，平行6份，按照1∶1的比例加入鞣花酸对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析并计算回收率。结果鞣花酸平均加样回收率为101.24%，RSD为1.68%。

2.3 响应面法优化鞣花酸提取工艺

2.3.1 单因素考察 以鞣花酸含量为评价指标，分别对甲醇浓度(60%、70%、80%、90%、100%)、提取时间(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)、液料比(10∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1)进行考察。结果见图2，由图2可知，以70%的甲醇、回流提取60 min，50∶1液料比提取效果最佳。

图2 单因素实验结果图

2.3.2 响应面设计 在单因素试验的基础上，选择甲醇浓度、提取时间、液料比为考察因素，利用Box-Behnken软件设计鞣花酸的提取条件，实验设计方案和结果见表1和表2。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平表

表2 响应面设计与结果

2.3.3 方差分析 方程回归分析及方差分析结果见表3。鞣花酸含量对甲醇浓度、提取时间、液料比的回归方程为：Y=0.35+0.008A+0.009B+0.031C+0.004AB+0.016AC-0.014BC-0.028A2-0.008B2-0.023C2。结果显示，在设定的区域内，所建立的模型达到极显著水平(P<0.0001)，其中二次项中A2和C2的P值均达到了极显著水平(P<0.01)，表明方程拟合较好。

表3 方差分析结果

2.3.4 响应面分析 应用 Design-Expert 9.0.4 软件绘制出所考察指标与影响较显著的3个自变量的等高线图，具体如图3所示。结果最佳提取工艺为：甲醇浓度73.32%、提取时间62.87 min、液料比58.76∶1，预测鞣花酸含量为0.355%。

图3 不同因素间的响应曲面图

2.2.5 试验验证 考虑到实际操作的方便可行性，将条件修正为：甲醇浓度73%、提取时间63 min、液料比60∶1，此条件下鞣花酸含量为0.353%，与预测值无显著差异，表明方程与实际情况拟合良好。

3 讨论

3.1 目标成分的选择 研究显示，鞣花酸药理作用广泛，既有抗炎、抗氧化、抑制细菌生长等活性，还具有改善肾小管损伤及肾纤维化作用，是覆盆子盐炙后补肾固涩作用增强的主要相关活性成分[8-9]。因此，本试验选择鞣花酸为目标成分进行工艺优化。

3.2 优化方法的选择 响应面法是一种通过回归方程来拟合各因素水平与响应值之间的函数关系，可精准预测任一条件组合下的响应值并直观地看出函数关系的优点，被广泛用于中药有效成分的提取工艺优化[10]。因此，本试验选择响应面法优选盐覆盆子有效成分鞣花酸的提取工艺。

3.3 流动相的选择 本试验考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸水、甲醇-酸水等不同液相条件，结果显示，以乙腈-0.2%磷酸水为流动相时，鞣花酸的峰形及分离度最好，这可能和鞣花酸是多酚二内酯结构有关，加入酸水可抑制其水解，从而改善峰形、增加分离度。

综上，鞣花酸是覆盆子盐制后补肾固涩作用增强的主要活性化合物。本实验优化所得的盐覆盆子中鞣花酸最佳提取工艺为：甲醇浓度73%、提取时间63 min、液料比60∶1，此条件下鞣花酸含量为0.353%，所建立的方法可为盐覆盆子有效成分的提取工艺研究和质量标准完善提供依据。