HPLC法测定抗骨髓炎片中绿原酸和秦皮乙素的含量

唐佳齐 何 艳 王 庆 黄 琴 杨 霞 张 辉

湘南学院药学院，湖南 郴州 423000

抗骨髓炎片收载在《中国药典》2020年版一部中，由金银花、蒲公英、紫花地丁、半枝莲、白头翁和白花蛇舌草组成的中药复方制剂，具有清热解毒、散瘀消肿之功效，用于热毒血瘀所致附骨疽及骨髓炎等症[1]。抗骨髓炎片现行质量标准仅测定绿原酸的含量作为质控指标，相关文献也仅有薄层扫描测定绿原酸[2]或HPLC测定白头翁皂苷B4[3]的含量，质控指标单一，难以有效控制制剂质量。方中金银花清热解毒、消炎退肿，蒲公英解热凉血，两者主要活性成分为绿原酸[4-5]；紫花地丁清热解毒，治痈疽疔肿，其主要活性成分为秦皮乙素[6]。为此，为了更加全面地控制该制剂的质量，本实验采用HPLC法测定抗骨髓炎片中绿原酸和秦皮乙素的含量，此法结果准确，重现性好，为有效控制该制剂的质量提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，XSE-205电子天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.01 mg)，DZKW-D电热恒温水浴锅(北京市永明医疗仪器有限公司)，KQ-500DE超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 材料 绿原酸对照品(批号：110753-201817，含量：96.8%)、秦皮乙素对照品(批号：110741-201708，含量：99.9%)均购自中国食品药品鉴定研究院。抗骨髓炎片(莱阳市江波制药有限责任公司，批号：2111253、2203022、2203052)，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂、试药均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Thermo Hypersil Gold-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈- 0.1%磷酸(9∶91)，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长327 nm，进样量10 μL。按上述色谱条件进样分析，绿原酸、秦皮乙素与其他色谱峰分离较好(分离度>1.5)，且阴性样品无干扰(如图1)。

A.混合对照品；B.供试品；C.缺金银花、蒲公英阴性样品；D.缺紫花地丁；1.绿原酸；2.秦皮乙素

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品绿原酸、秦皮乙素7.47 mg、6.28 mg，各置20 mL量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度。分别精密量取 4 mL、1 mL 置10 mL量瓶中，得混合对照品储备溶液(绿原酸144.6 μg·mL-1、秦皮乙素31.37 μg·mL-1)。

2.3 供试品溶液的制备 取抗骨髓炎片20片，除去糖衣，研细，精密称取0.8 g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声(功率500 W，频率40 kHz)提取30 min，放冷至室温，再称定重量，减失的重量用70%甲醇补足，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 取按处方工艺制成不含蒲公英和金银花、不含紫花地丁的阴性样品，取适量研细，按“2.3”项下方法制成缺蒲公英和金银花、缺紫花地丁的阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下的对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件测定绿原酸和秦皮乙素的峰面积，以进样质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，进行线性回归。绿原酸、秦皮乙素分别在14.46～144.6 μg·mL-1、3.137～31.37 μg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程分别为Y=29.97X+0.0071(r=0.9999)、Y=28.59X-0.6687(r=0.9999)。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品储备溶液适量，用70%甲醇稀释2倍，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，测定绿原酸、秦皮乙素的峰面积。结果绿原酸、秦皮乙素峰面积的RSD为0.15%、0.18% ，结果表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品(批号：2111253)溶液10 μL，分别在0 h、3 h、5 h、7 h、10 h、12 h依次进样，测定绿原酸、秦皮乙素的峰面积。结果绿原酸、秦皮乙素峰面积的RSD为0.43%、0.95% ，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 精密称取同一批样品(批号：2111253)6份，照“2.3”项下制备，得6份供试品溶液，分别进样10 μL，测定绿原酸、秦皮乙素的峰面积。结绿原酸、秦皮乙素含量分别为 4.927 mg·g-1、1.079 mg·g-1，RSD分别为0.37%(n=6)、1.73%(n=6)，表明该方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号：2111253)6份，精密称取0.4 g，置具塞锥形瓶中，按1∶1的比例分别加入绿原酸、秦皮乙素对照品溶液(0.3833 mg·mL-1绿原酸 5mL、0.4076 mg·mL-1秦皮乙素1 mL )，用70%甲醇补足至50 mL，按“2.3”项下方法制备供试品液，进样10 μL，测定绿原酸、秦皮乙素峰面积，代入标准曲线计算含量，并计算回收率，结果绿原酸、秦皮乙素平均回收率分别为98.65%(RSD= 0.75%)、96.51%(RSD= 1.58%)，结果准确度良好。见表1。

表1 绿原酸、秦皮乙素加样回收率试验结果(n=6)

2.10 含量测定 取3个批次的抗骨髓炎片样品，除去糖衣，研细，精密称取0.8 g，按“2.3”项下方法各平行制备2份供试品溶液，分别吸取10 μL，进样测定绿原酸、秦皮乙素峰面积，代入标准曲线计算含量。见表2。

表2 样品中2种成分含量测定的结果(mg·g-1，n=2)

3 讨论

3.1 测定波长的选择 采用二极管阵列检测器在波长190～400 nm对绿原酸、秦皮乙素对照品溶液进行紫外扫描，发现绿原酸在327 nm、秦皮乙素在345 nm具有最大吸收，综合考虑故本文选用327 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件优化 依据文献[7-8]方法，本文比较了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，实验结果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，绿原酸和秦皮乙素的分离效果较好，当增加磷酸浓度时，2个成分色谱峰峰形无明显变化，故选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。再考察了不同色谱柱[Agilent ZORBAX SB C18、SHIMADU Shim-pack-C18、Thermo Hypersil Gold-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)]、不同仪器(Agilent 1260、SHIMADU LC-20AT )对2个成分测定时分离效果的影响，结果均能实现较好的分离。

3.3 供试品制备方法的选择 预实验采用不同溶剂(乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇)进行超声和加热回流提取，结果显示，采用70%甲醇超声提取时，绿原酸和秦皮乙素提取率高，且峰形较佳，超声提取能明显缩短提取时间；再考察了超声提取30 min、40 min、50 min、60 min，结果超声提取40 min时，绿原酸和秦皮乙素基本提取完全，故选择超声提取40 min。

综上所述，本研究采用HPLC法同时测定抗骨髓片中2种有效成分的含量，涵盖了制剂中的君药和臣药，方法简单易行、专属性好、准确度高，为更为全面地控制抗骨髓炎片的质量和完善其质量标准提供实验基础。